采用重组酶介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用重组酶介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法，属于植物细菌学诊断技术领域。该方法主要包括：猕猴桃溃疡病菌总DNA的提取，RPA反应和2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，从分子水平对猕猴桃溃疡病菌进行快速检测。本发明专利技术具有快速、灵敏、方便、特异性等特点。与常规PCR方法相比，本发明专利技术筛选获得的引物对目标片段的扩增具有较高的特异性和稳定性，扩增时间短，反应不需退火，在恒温培养箱、水浴锅、人体温等能够维持所需温度的任何条件即可保持RPA反应具有较高的活性，无需昂贵的仪器设备。本发明专利技术成功建立了猕猴桃溃疡病菌的检测体系，并通过样品检测验证了该体系的实用性，为猕猴桃溃疡病菌的检测提供了一种快速有效的新方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物细菌学诊断
，特别涉及采用等温扩增技术来检测植物病 菌，具体为一种。
技术介绍
我国是猕猴桃的主要产区，其种植面积和产量均居世界之首。猕猴桃溃疡病是一 种毁灭性的病害，对我国猕猴桃各大产区都有不同程度的危害，严重威胁到我国猕猴桃产 业的可持续发展，被列为全国森林植物检疫防治对象。此病来势凶猛，发病时会直接影响到 猕猴桃的产量及果实质量，给我国猕猴桃产业造成严重的经济损失。 猕猴桃溃疡病危害严重及防治困难，一直是猕猴桃生产和理论上的一个重要问 题。目前很难找到一种有效的方法进行防治。其病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae, PSA)，该菌有较长的潜伏期，致病力强，一旦侵 染，2-3年后将造成大规模毁园，因此，早期对其准确检测是猕猴桃细菌性溃疡病防治的重 要前提。因此，建立高效、快速、方便、准确的检测方法尤为重要，这有助于苗木的早期诊断 和及时防治。 传统的生理生化方法鉴定猕猴桃溃疡病菌，是一种繁琐，费时的方法，且往往达不 到预期的效果，不能实现对病菌的早期检测。近年来，分子检测技术的发展为植物病原菌的 鉴定提供了更为有力的工具，此项技术可以直接从DNA层面确定病原菌，使得病原的鉴定， 病害的诊断变得更为快速准确。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR)是一 种常用的病菌分子检测技术，由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的 变性：模板DNA经加热至94°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链 DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火 (复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA单链的互补 序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板一引物结合物在72°C，DNA聚合酶（如TaqDNA聚 合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性一退火一延伸三过程就 可获得更多的"半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。PCR技术需要一 定的温度条件和适宜的变性、退火和延伸时间来满足反应要求，过程控制不好，容易出现假 阳性或无法扩增目标条带，耗时过长。重组酶介导等温扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA)技术被认 为是可以取代PCR的核酸检测技术。RPA技术本质上就是一个恒温的反应过程，其最合适的 温度在37°C -42°C之间，无需变性，变温，退火等过程，在常温下反应即可，反应过程简单， 一般十五分钟左右即可获得可检出的扩增产物。目前这种技术已经被应用于冠状病毒，HIV 病毒，癌症等方面的检测，但在植物病菌学领域，特别是在猕猴桃溃疡病菌的早期检测却没 有相关的应用。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术将重组酶介导等温扩增技术应用到猕猴桃溃疡病菌 的诊断及防治领域，建立一种早期诊断方法。 本专利技术提供了一种。该 方法主要包括猕猴桃溃疡病菌总DNA的提取，RPA反应和2. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，从分 子水平对猕猴桃溃疡病菌进行快速检测。 本专利技术所述一种，主要 包括以下步骤： 1)重组酶介导等温扩增（RPA)引物的设计； 2)猕猴桃溃疡病菌的培养； 3)猕猴桃溃疡病菌总DNA的提取； 4)RPA 反应； 5) 2. 5 %琼脂糖凝胶电泳检测。 RPA的引物设计比PCR引物长，一般需要达到30-35bp个碱基长度，引物过短会降 低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。作为一种优选，所述引物设计为： RPA Psal-F: 5' -CCTGATAAGGGTGAGGTCGGCAGTTCGAATC-3' RPA Psal-R:5,-TCACGCACCCTTCAATCAGGATGGAATGCTC-3， 作为一种优选，所述猕猴桃溃疡病菌的培养为：将猕猴桃溃疡病菌放入液体LB培 养基中，在22°C条件下培养12小时。 作为一种优选，所述猕猴桃溃疡病菌总DNA的提取为：将上述培养液离心后收集 溃疡病菌，从病菌中提取总DNA。 作为一种优选，所述RPA反应为：以猕猴桃溃疡病菌的DNA为模板，将RPA反应管 放在37°C恒温水浴15-30分钟，得到扩增的目标产物。 RPA反应主要依赖于三种酶：重组酶蛋白，单链DNA结合蛋白及DNA聚合酶。重组 酶蛋白可以在ATP的参与下结合单链DNA(引物）并形成DNA核蛋白微丝，核蛋白微丝两端 都可以延长，并且可以通过前端伸长后端缩短的方法向双链DNA分子运动。微丝能够拽住 周围的DNA分子，将单链的寡核苷酸序列与DNA序列进行比对，当找到匹配的序列时，两个 分子就会紧密结合到一起确保重组跟着发生。DNA的螺旋构象以及核蛋白微丝的长度对搜 索识别同源序列的效率起重要作用，在单链结合蛋白的帮助下，模板DNA开始解链，引物入 侵双链DNA并开始配对形成复制所需自由的3'羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制 延伸，所形成新的DNA互补链反应产物也是以指数级增长，整个反应过程进行的非常快，一 般十几分钟即可得到可检测的猕猴桃溃疡病菌的扩增产物。 作为本专利技术具体实施例中的一种优选方式，所述RPA反应可以通过下述方式实 现：向含有冻干酶粉的〇. 2ml TwistAmp Basic反应管中加入再水化缓冲液29. 5 y L，去离 子水12. 2 y L，然后分装在两个0. 2ml的反应管中，向两管中各加入引物1 y L(10 ymol/L)， 细菌基因组DNA2 y L (50ng/ y L)，最后加入醋酸镁溶液1. 25 y L (280mmol/L)，充分混匀后 在37°C恒温水浴中反应15-30分钟，得到扩增产物。 冻干粉中含有RPA反应的几种酶，包括重组酶、单链结合蛋白及聚合酶等，再水化 缓冲液的作用是溶解这些酶类，并在RPA反应中提供稳定的缓冲体系，醋酸镁具有启动RPA 当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用重组酶介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的上游引物，其特征在于，核苷酸序列为：CCTGATAAGGGTGAGGTCGGCAGTTCGAATC。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨辉，陈航，龚国淑，刘童，李庆，张敏，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51