表达葡萄糖脱氢酶的工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了表达葡萄糖脱氢酶的工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术所提供的表达葡萄糖脱氢酶的工程菌为具有溶磷活性的重组微生物。该具有溶磷活性的重组微生物通过赋予受体微生物葡萄糖脱氢酶活性来制备；所述具有溶磷活性的重组微生物的溶磷活性高于所述受体微生物。本发明专利技术通过赋予受体微生物(巨大芽孢杆菌WH320)葡萄糖脱氢酶CrGDH3A的活性构建具有溶磷活性的重组微生物，该重组微生物对磷酸三钙的溶磷能力是受体微生物的11.59倍，对磷酸铝的溶磷能力是其相应的受体微生物的16.23倍,对磷矿粉的溶磷能力是其相应的受体微生物的14.00倍。

【技术实现步骤摘要】
表达葡萄糖脱氢酶的工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及生物领域中表达葡萄糖脱氢酶的工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
在农业生产上，增施磷肥是一种“高投入，低产出”的途径。我国每年大约消耗2100万～2200万吨磷肥，但是磷肥当季作物利用率仅为5％-25％，90％左右的磷肥施入土壤后很快被化学固定，形成溶解性极低的磷酸钙、铁、铝等化合物。磷是不可再生资源，随着磷矿储备的不断消耗，我国可能面临磷矿短缺而严重制约粮食生产。其实土壤中本不缺磷,但是它在土壤中的有效性非常低,多为难溶性的无机磷，植物很难吸收利用。因此，活化土壤中无效磷素，是农业生产急需解决的问题之一。葡萄糖脱氢酶(glucosedehydrogenase，GDH)属于短链乙醇脱氢酶家族的一员，在辅酶存在下，能够催化D-葡萄糖转化成D-葡萄糖酸-δ-内酯，而生成的D-葡萄糖酸-δ-内酯会进一步自发地水解成葡萄糖酸。研发具有高活性的葡萄糖脱氢酶进而构建葡萄糖脱氢酶溶磷工程菌，可以显著提高溶磷细菌分解土壤无机磷的能力，在活化土壤无效磷素、提高磷肥利用率、减少磷肥投入方面具有重大价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何构建具有溶磷活性的微生物。为了解决以上技术问题，本专利技术提供了具有溶磷活性的重组微生物。本专利技术所提供的具有溶磷活性的重组微生物，是通过赋予受体微生物葡萄糖脱氢酶活性来制备；所述具有溶磷活性的重组微生物的溶磷活性高于所述受体微生物。上述重组微生物中，所述赋予受体微生物葡萄糖脱氢酶活性通过将葡萄糖脱氢酶的编码基因导入受体微生物中实现。为了解决以上技术问题，本专利技术提供了构建具有溶磷活性重组微生物的方法。本专利技术所提供的构建具有溶磷活性重组微生物的方法，包括将葡萄糖脱氢酶的编码基因导入受体微生物，得到溶磷活性高于所述受体微生物的具有溶磷活性重组微生物；所述葡萄糖脱氢酶为a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQIDNo.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQIDNo.2或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。本申请中，所述溶磷活性是指将无机磷转化为可溶性磷的能力。其中，可溶性磷指能溶解到水中或溶解到弱酸中后可被植物吸收利用的磷。可溶性磷包括水溶性磷和/或可交换性磷。所述无机磷可为难溶的磷酸盐(如磷酸三钙或磷酸铝)或磷矿粉。上述方法中，a)所示的蛋白质的名称为CrGDH3A；SEQIDNo.2由796个氨基酸残基组成。上述方法中，b)所示的蛋白质的名称为CrGDH3A-His，SEQIDNo.2所示的CrGDH3A的N端连接MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的融合蛋白，SEQIDNo.6由817个氨基酸残基组成。上述方法中，蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。所述编码基因具体可为如下1)或2)或3)所示的葡萄糖脱氢酶的编码基因：1)编码序列(CDS)是SEQIDNo.1所示的DNA分子，其名称为CrGDH3A基因；2)编码序列是SEQIDNo.5所示的DNA分子，其名称为CrGDH3A-His基因；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述葡萄糖脱氢酶的DNA分子。所述编码基因中，“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述重组微生物或方法中，所述受体微生物可为原核微生物。上述重组微生物或方法中，所述原核微生物具体可为革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。上述重组微生物或方法中，所述革兰氏阴性细菌具体可为埃希氏菌属细菌。所述革兰氏阳性细菌具体可为芽孢杆菌属细菌。上述重组微生物或方法中，所述埃希氏菌属细菌具体可为大肠杆菌。所述芽孢杆菌属细菌可为巨大芽孢杆菌。上述重组微生物或方法中，上述葡萄糖脱氢酶的编码基因可通过重组表达载体pET–CrGDH3A导入所述受体微生物；所述pET–CrGDH3A是用SEQIDNo.1所示的CrGDH3A基因替换pET-28a(+)的NdeI和BamHI识别位点间的片段得到的重组表达载体。pET–CrGDH3A含有SEQIDNo.5所示的CrGDH3A-His编码基因，CrGDH3A-His编码基因编码的蛋白质CrGDH3A-His的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。CrGDH3A-His是SEQIDNo.2所示的CrGDH3A的N端连接MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的融合蛋白。上述重组微生物或方法中，上述葡萄糖脱氢酶的编码基因还可通过重组表达载体pWH–CrGDH3A导入所述受体微生物；所述pWH–CrGDH3A是用SEQIDNo.1所示的CrGDH3A基因正向替换pWH1520的2个BamHI识别位点间的片段得到的重组表达载体。pWH–CrGDH3A含有序列表中SEQIDNo.1所示的CrGDH3A基因，pWH–CrGDH3A表达是SEQIDNo.2所示的蛋白质CrGDH3A。上述重组微生物或方法在溶解无机磷中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述应用中，所述无机磷可为难溶的磷酸盐(如磷酸三钙或磷酸铝)或磷矿粉。与所述葡萄糖脱氢酶相关的生物材料也属于本专利技术的保护范围，所述生物材料为B1)或B2):B1)含有所述编码基因的表达盒；B2)含有所述编码基因的重组载体。上述B2)中的重组载体具体可为上述pWH–CrGDH3A或pET–CrGDH3A。上述生物材料在制备葡萄糖脱氢酶中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述生物材料在制备具有溶磷活性重组微生物中的应用也属于本专利技术的保护范围。实验证明，在模式细菌原核表达中(大肠杆菌为受体菌)，葡萄糖脱氢酶CrGDH3A和CrGDH3A-His均具有较高的葡萄糖脱氢酶活性，葡萄糖脱氢酶CrGDH3A-His在25℃pH7.8的条件下其葡萄糖脱氢酶的酶活力为39.47±1.03U/mg蛋白；在溶磷工程菌中(巨大芽孢杆菌WH320为受体菌)，葡萄糖脱氢酶CrGDH3A在40℃，pH7.4的条件下的葡萄糖脱氢酶的酶活力为36.53±1.16U/mg。本专利技术通过赋予受体微生物(巨大芽孢杆菌WH320)葡萄糖脱氢酶CrGDH3A活性构建具有溶磷活性的重组微生物，该重组微生物对磷酸三钙的溶磷能力是受体微生物的11.59倍，对磷酸铝的溶磷能力是其相应的受体微生物的16.23倍,对磷矿粉的溶磷能力是其相应的受体微生物的14.00倍。本专利技术为应用基因工程手段培育磷高效农作物新品种以及高效活化土壤磷素养分的生物工程菌提供重要基因资源，有助于推动溶磷工程菌从实验室研发阶段向田间应用阶段迈进。附图说明图1为pET–CrGDH3A和pET–CrGDH3B的物理图谱。其中，gdh3为CrGDH3A基因或CrGDH3B基因。图2为在大肠杆菌中诱导表达葡萄糖脱氢酶的SDS-PAGE图谱。其中，1：蛋白Marker；本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有溶磷活性的重组微生物，所述具有溶磷活性的重组微生物通过赋予受体微生物葡萄糖脱氢酶活性来制备；所述具有溶磷活性的重组微生物的溶磷活性高于所述受体微生物。

【技术特征摘要】
1.具有溶磷活性的重组微生物，所述具有溶磷活性的重组微生物通过赋予受体微生物葡萄糖脱氢酶活性来制备；所述具有溶磷活性的重组微生物的溶磷活性高于所述受体微生物。2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于：所述赋予受体微生物葡萄糖脱氢酶活性通过将葡萄糖脱氢酶的编码基因导入受体微生物中实现。3.构建权利要求1或2所述的具有溶磷活性的重组微生物的方法，包括将葡萄糖脱氢酶的编码基因导入受体微生物，得到溶磷活性高于所述受体微生物的具有溶磷活性的重组微生物。4.根据权利要求1或2所述的重组微生物或权利要求3所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶为a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQIDNo.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQIDNo.2或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙静文，周卫，程明芳，李书田，王玉军，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11