一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法技术

本发明专利技术公开了一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法。它包括以下步骤：选取待测植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片剪碎充分混合，取其中0.1g进行酶液的提取，分别测定提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖激酶活力和葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶的酶活力，依据公式计算出糖代谢中的糖酵解途径份额、磷酸戊糖途径份额以及糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例。本发明专利技术能快速定量不同环境下植物体糖代谢中的糖酵解途径份额、磷酸戊糖途径份额以及糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例，步骤少，计算简单，测定结果具有可比性以及可靠性，可以整体反映植物在环境变化时葡萄糖代谢的歧化情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法，属于生物生理生化领域。
技术介绍
生物在不利生境条件下，往往通过在形态和生理上发生改变使它们能适应环境的变化以获得生存的机会。生物的生长发育都是以代谢为基础。因此，判断生物在逆境情况下代谢系统发生的复杂变化，是研究植物对环境的适应性的基础。葡萄糖代谢是维持生命体基本活动的最重要的代谢过程，为生命体提供能量、还原力和合成其他生物大分子的底物。生命体内葡萄糖的代谢途径有很多种，分别是糖酵解途径、磷酸戊糖途径、糖醛酸途径、有氧氧化途径、多元醇途径、糖原合成与糖原分解、糖异生以及其他己糖代谢。其中，糖酵解途径和磷酸戊糖途径是葡萄糖的两个最主要的代谢途径，两者占葡萄糖代谢的份额超过80％，在植物体中占的比例更大。糖酵解途径为生命体提供进行生命活动所必须的能量---ATP，而磷酸戊糖途径为生命体提供物质合成和抵抗不利环境所需的还原力---NAPDH。研究代谢途径的调控情况，常常通过研究其限速酶的活性变化来进行。在糖酵解途径中，磷酸果糖激酶(PFK)是此途径的限速酶，其功能是不可逆的催化果糖-6-磷酸生成果糖-1，6-二磷酸，导致葡萄糖进入糖酵解途径进行代谢；而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖途径的限速酶，其功能为催化葡萄糖-6-磷酸不可逆的转化为6-磷酸葡萄糖酸，从而导致葡萄糖进入磷酸戊糖途径进行代谢。以往常常通过研究一个代谢途径或几个代谢途径的变化情况来研究植物葡萄糖代谢在环境变化时发生的改变，这样的研究方法割裂了各个代谢途径之间的联系，难以反映各代谢途径之间的影响，不能够反映生物葡萄糖代谢整体的变化情况。因此，建立一种能反映葡萄糖代谢整体变化趋势的方法，对研究生物葡萄糖代谢在环境变化时的歧化情况具有极其重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种利用糖酵解途径和磷酸戊糖途径限速酶酶活力比值判断葡萄糖代谢歧化情况的方法，以克服现有技术难以反映葡萄代谢整体变化情况的弱点。本专利技术采取以下技术方案：它包括以下步骤：第一，选取待测植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片；第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1g进行酶液的提取；第三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖激酶活力EApfk；第四，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh；第五，将磷酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh累加获得糖代谢关键酶的总活性EA∑，计算公式为EA∑＝EApfk+EAg6pdh；第六，依据磷酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键酶的总活性EA∑，计算出糖代谢中的糖酵解途径份额PEMP，计算公式为PEMP＝EApfk/EA∑；第七，依据葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh和糖代谢关键酶的总活性EA∑，计算出糖代谢中的磷酸戊糖途径份额PPPP；计算公式为PPPP＝EAg6pdh/EA∑；第八，依据糖代谢中的糖酵解途径份额PEMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额PPPP，计算出糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例P，计算公式为P＝PEMP/PPPP。在第二步中，酶液的提取方法为：取的叶片组织放置于冰浴研钵中，加入液氮进行冷冻研磨，待液氮挥发后，加入酶提取液；把研磨后的匀浆移入离心管中，离心，取上清液冷藏待测；其中酶提取液为50mM HEPES Tris-HCl(pH 7.8)，3mM MgCl2，1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇和1mM苯甲基磺酰氟；这里的HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，Tris-HCl为盐酸三羟甲基氨基甲烷，EDTA为乙二胺四乙酸。在第四步骤中，酶液中磷酸果糖激酶的酶活力EApfk的测定方法为：磷酸果糖激酶的酶活力等于ATP-PFK酶活力加上PPi-PFK酶活力；ATP-PFK酶活力的测定方法如下，把200μL酶提取液加入到1.8mLATP-PFK酶活分析液中，利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化D1；ATP-PFK酶活分析液pH 7.8，包括50mM HEPES Tris-HCl，2.5mM MgCl2，0.1mM NADH，5mM果糖-6-磷酸，2unit mL的醛缩酶，1unit mL丙糖磷酸异构酶，2unit mL 3-磷酸甘油脱氢酶和1mMATP；PPi-PFK酶活力的测定方法如下:把200μL酶提取液加入到1.8mL PPi-PFK酶活分析液中,利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化D2；PPi-PFK酶活分析液pH7.8，包括50mM HEPES Tris-HCl，2.5mM MgCl2，0.1mM NADH，5mM果糖-6-磷酸，2unit mL的醛缩酶，1unit mL丙糖磷酸异构酶，2unit mL 3-磷酸甘油脱氢酶和1mM PPi；酶液中磷酸果糖激酶的酶活力EApfk可表示为D1+D2；这里的PFK为磷酸果糖激酶，ATP为三磷酸腺苷，PPi为焦磷酸，NADH为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型辅酶I。在第五步骤中，酶液中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh的测定方法为：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力等于G6PDH和6PGDH总酶活力减去6PGDH酶活力；测定G6PDH和6PGDH的总活力的方法为：把200μL酶提取液加入到1.8mL G6PDH和6PGDH总酶活分析液中，利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化DT；G6PDH和6PGDH总酶活分析液pH 7.8，包括50mM HEPES Tris-HCl，3.3mM MgCl2，0.5mM 6-磷酸葡萄糖酸脂二钠盐，0.5mM 6-磷酸葡萄糖酸脂和0.5mM NADPNa2；6PGDH的酶活力的测定方法：把200μL酶提取液加入到1.8mL 6PGDH酶活分析液中，利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化DP；6PGDH酶活分析液pH 7.8，包括50mM HEPES Tris-HCl，3.3mM MgCl2，0.5mM 6-磷酸葡萄糖酸脂和0.5mM NADPNa2；酶液中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh可表示为DT-DP；这里的G6PDH为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，6PGDH为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，NADPNa2为氧化型型辅酶II二钠盐。在第六、七和八步骤中，糖代谢中的糖酵解途径份额、糖代谢中的磷酸戊糖途径份额以及糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例均以百分比值来进行体现。本专利技术的优点如下：1)由于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或还原型辅酶II(NADPH)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型辅酶I(NADH)在340nm的毫摩尔消光系数均为6.22mM-1cm-1，测出的磷酸果糖激酶的酶活力和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力量纲相同，一个单位的葡萄糖通过糖酵解途径消耗2个单位的NADH，而通过PPP途径恰好生成2个单位的NADPH，因此，用磷酸果糖激酶的酶活力和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力代表两个途径无需归一化，计算出的糖代谢中的糖酵解途径份额本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法，其特征在于：它包括以下步骤：第一，选取待测植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片；第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中进行酶液的提取；第三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖激酶活力EApfk；第四，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh；第五，将磷酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh累加获得糖代谢关键酶的总活性EA∑，计算公式为EA∑＝EApfk+EAg6pdh；第六，依据磷酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键酶的总活性EA∑，计算出糖代谢中的糖酵解途径份额PEMP，计算公式为PEMP＝EApfk/EA∑；第七，依据葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh和糖代谢关键酶的总活性EA∑，计算出糖代谢中的磷酸戊糖途径份额PPPP；计算公式为PPPP＝EAg6pdh/EA∑；第八，依据糖代谢中的糖酵解途径份额PEMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额PPPP，计算出糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例P，计算公式为P＝PEMP/PPPP。...

【技术特征摘要】
1.一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法，其特征在于：它包括以下步骤：第一，选取待测植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片；第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中进行酶液的提取；第三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖激酶活力EApfk；第四，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh；第五，将磷酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh累加获得糖代谢关键酶的总活性EA∑，计算公式为EA∑＝EApfk+EAg6pdh；第六，依据磷酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键酶的总活性EA∑，计算出糖代谢中的糖酵解途径份额PEMP，计算公式为PEMP＝EApfk/EA∑；第七，依据葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh和糖代谢关键酶的总活性EA∑，计算出糖代谢中的磷酸戊糖途径份额PPPP；计算公式为PPPP＝EAg6pdh/EA∑；第八，依据糖代谢中的糖酵解途径份额PEMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额PPPP，计算出糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例P，计算公式为P＝PEMP/PPPP。2.根据权利要求1所述的一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法，其特征在于：在第二步中，酶液的提取方法为：取的叶片组织放置于冰浴研钵中，加入液氮进行冷冻研磨，待液氮挥发后，加入酶提取液；把研磨后的匀浆移入离心管中，离心，取上清液冷藏待测；其中酶提取液为HEPES Tris-HCl、MgCl2、EDTA、二硫苏糖醇和苯甲基磺酰氟；这里的HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，Tris-HCl为盐酸三羟甲基氨基甲烷，EDTA为乙二胺四乙酸。3.根据权利要求1所述的一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法，其特征在于：在第四步骤中，酶液中磷酸果糖激酶的酶活力EApfk的测定方法为：磷酸果糖激酶的酶活力等于ATP-PFK酶活力加上PPi-PFK酶活力。4.根据权利要求1所述的一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法，其特征在于：在第五步骤中，酶液中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh的测定方法为：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力等于G6PDH和6PGDH总酶活力减去6PGDH酶活力。5.根据权利要求1所述的一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法，其特征在于：在第六、七和八步骤中，糖代谢中的糖酵解途径份额、糖代谢中的磷酸戊糖途径份额以及糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例均以百分比值来进行体现。6.根据权利要求3所述的一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法，其特征在于：ATP-PFK酶活力的测定方法如下，把酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴沿友，姚凯，杭红涛，王瑞，张开艳，饶森，陆叶，赵丽华，李海涛，刘丛强，
申请(专利权)人：中国科学院地球化学研究所，
类型：发明
国别省市：贵州;52