发酵戊糖的细胞制造技术

本发明专利技术涉及发酵戊糖的细胞。本发明专利技术涉及包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的细胞，其中所述木糖异构酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:3中示出的氨基酸序列具有至少约70％的序列同一性，并且其中所述核苷酸序列对所述宿主是异源的。本发明专利技术的细胞可用于生产发酵产物如乙醇的方法中。这类方法可包含用本发明专利技术的细胞发酵含有木糖来源的培养基，使得所述细胞将木糖发酵成为所述发酵产物。

【技术实现步骤摘要】
发酵戊糖的细胞本申请是基于申请号为200980108010.4、申请日为2009年3月5日、申请人为帝斯曼知识产权资产管理有限公司、名称为“发酵戊糖的细胞”的中国专利技术专利申请的分案申请。专利
本专利技术涉及能够将木糖异构化为木酮糖的细胞。本专利技术还涉及其中使用这类细胞生产发酵产物例如乙醇的方法。专利技术背景最近几十年，传统化石燃料(基于石油的燃料)的大规模消耗造成了高水平的污染。这与化石燃料的世界储备并非有限的认识以及增长的环境意识一起刺激了研究替代性燃料(如乙醇)可行性的新动机，所述替代性燃料是以每升为基础比无铅汽油释放更少CO2的无粒子燃烧燃料来源。尽管生物量衍生的乙醇可以通过得自许多不同来源的己糖的发酵来生产，但是，典型地用于商业规模生产燃料醇的底物如甘蔗和玉米淀粉是昂贵的。因此，燃料乙醇生产的提高会需要使用更低成本的原料。目前，只有衍生自植物生物量的木质纤维素原料能够足量获得，用于代替目前用于乙醇生产的作物。在大部分木质纤维素材料中，在葡萄糖之后第二常见的糖是木糖。因此，对于经济上可行的燃料生产工艺而言，己糖和戊糖均必须被发酵形成乙醇。酵母Saccharomycescerevisia是有活力的并且充分适合乙醇生产，但是不能使用木糖作为碳源生产乙醇。另外，没有一种天然存在的生物是已知能够以高乙醇产量以及高乙醇生产力将木糖发酵成乙醇的。因此，对下述生物存在需要，所述生物具有这些特性从而能够在商业上有活力地从木质纤维素原料生产乙醇。专利技术概述根据本专利技术，提供了能够发酵(例如醇发酵)和使用木糖作为碳源的细胞。这样的细胞包含编码木糖异构酶的核苷酸序列，其中木糖异构酶的氨基酸序列与SEQIDNO:3中公开的氨基酸序列具有至少约70％的序列同一性，并且其中所述核苷酸序列对所述宿主来说是异源的。这样的细胞在使用木糖作为碳源时，与野生型丝状真菌相比生产更大量的乙醇。本专利技术还提供了-生产发酵产物的方法，所述方法包括用本专利技术的细胞发酵含有木糖来源的培养基，使得所述细胞将木糖发酵成所述发酵产物；-生产发酵产物的方法，所述方法包括用本专利技术定义的还能够利用L-阿拉伯糖的细胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，使得细胞将木糖和L-阿拉伯糖发酵成为所述发酵产物；和-生产发酵产物的方法，所述方法包括用本专利技术的细胞和能够使L-阿拉伯糖的细胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，其中每种细胞将木糖和/或阿拉伯糖发酵成为所述发酵产物。本专利技术还提供了本专利技术的细胞在生产发酵产物的方法中的用途。附图概述图1公开了用于在Saccharomycescerevisiae中表达的编码来自BacteroidesuniformisATCC8492的木糖异构酶的pYISIT4-XKS1-xylA(BaunCpO)的质粒图谱。CpO表示经密码子对优化。图2公开了质粒pPWT080的物理图谱，其序列在SEQIDno.4中给出。图3公开了野生型GRE3-基因座的物理图谱(图a)和GRE3-基因座中PWT080的1拷贝整合(展示引物在何处结合的图b，和展示RKI1-探针在何处结合的图c)。图4公开了放射自显影图，显示CEN.PK113-7D中1拷贝质粒pPWT080的正确整合；图a：染色体DNA制剂的XcmI-消化，与RKI1-探针杂交。第1道：CEN.PK113-7D；第2道：BIE104F1；第3道：BIE104P1图b：染色体DNA制剂的PsiI-消化，与RKI1-探针杂交。第1道：CEN.PK113-7D；第2道：BIE104F1；第3道：BIE104P1ΔGRE3::PPP代表用含有处于强组成型启动子控制下的基因TAL1、TKL1、RKI1和RPE1的盒代替GRE3-基因的编码区，ΔGRE3::[TPI1p-TAL1-ADH1p-TKL1-PGI1p-RPE1-ENO1p-RKI1]。图5公开了GRE3-基因座的物理图谱，其中通过PPP-基因TAL1、TKL1、RKI1和RPE1的整合代替GRE3-基因的编码区。图a展示SEQID5和6引物在何处结合，图b展示RKI1-探针在何处结合。图6公开了质粒pYI#SIT4的物理图谱。图7公开了质粒pPWT007的物理图谱。图8公开了质粒pPWT042的物理图谱。图9公开了野生型SIT4-基因座(图a)和SIT4-基因座中PWT080的1拷贝整合(图b，展示引物在何处结合)的物理图谱。图10公开了BIE104P1Y9在2％木糖作为唯一碳源上、在若干次预培养后的生长曲线，和基因组中未整合1拷贝pPWT042的参照菌株的生长曲线。图中用数字表示事件：(1)：转移至YNB1％葡萄糖+1％木糖；(2)：转移至YNB0.1％葡萄糖+2％木糖；(3)转移至YNB2％木糖；(4)转移至YNB2％木糖(仅BIE104P1Y9)。图11公开了参照菌株BIE104P1和木糖代谢菌株BIE104P1Y9的生长曲线。图12公开了在葡萄糖上预培养的BIE104P1(图a)、在葡萄糖上预培养的BIE104P1Y9(图b)和在木糖上预培养的BIE104P1Y9(图c)菌株随时间的木糖和葡萄糖消耗与乙醇生产。图13公开了质粒pPWT018的物理图谱。图14公开了质粒pPWT006的物理图谱。图15公开了Southern印迹放射自显影图。用EcoRI以及HindIII二者消化野生型菌株CEN.PK113-7D(第1道)和BIE104A2(第2道)的染色体DNA。将所述印迹与特异性SIT2-探针杂交。图16公开了野生型SIT2-基因座(图a)的物理图谱，和通过质粒pPWT018的整合引入ara-基因后，之后的分子内重组导致载体和可选择标记物序列的丢失(图b)。标明了探针的杂交。图17公开了菌株BIE104A2P1Y9在不同培养基上的生长曲线的图示。图a：在半乳糖上生长的菌株BIE104A2P1Y9，之后是图中通过以下数字标明的事件：(1)转移至1％阿拉伯糖+1％木糖，和(2)转移至2％木糖+0.2％阿拉伯糖。图b：在葡萄糖上生长的菌株BIE104A2P1Y9，之后是(1)转移至1％阿拉伯糖+1％木糖和(2)转移至2％木糖+0.2％阿拉伯糖。序列表简述SEQIDNO:1公开了来自BacteroidesuniformisATCC8492的野生型木糖异构酶序列。Genbank登记号AAYH02000036。SEQIDNO:2公开了衍生自SEQIDNO:1的经密码子优化的序列。SEQIDNO:3公开了来自BacteroidesuniformisATCC8492的木糖异构酶的氨基酸序列。SEQIDNO:4公开了质粒pPWT080的序列。SEQIDNO:5公开了正向引物的序列。SEQIDNO:6公开了反向引物的序列。SEQIDNO:7公开了用于诊断性PCR的多功能正向引物的序列。SEQIDNO:8公开了用于诊断性PCR的多功能反向引物的序列。SEQIDNO:9公开了正向引物RKI1-探针的序列。SEQIDNO:10公开了反向引物RKI1-探针的序列。SEQIDNO:11公开了正向引物kanMX-盒的序列。SEQIDNO:12公开了反向引物kanMX-盒的序列。SEQIDNO:13公开了正向引物的序列。SEQIDNO:14公开了反本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的细胞，其中所述木糖异构酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:3中示出的氨基酸序列具有至少约70％的序列同一性，并且其中所述核苷酸序列对所述宿主来说是异源的。

【技术特征摘要】
2008.03.07 EP 08102407.71.包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的Saccharomyces细胞，其中所述木糖异构酶的氨基酸序列与SEQIDNO:3中示出的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性，其中所述核苷酸序列对所述宿主来说是异源的，并且其中所述木糖异构酶来自Bacteroidesuniformis。2.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞包含一种或多种遗传修饰，所述遗传修饰导致：a.所述细胞中木糖转运提高；b.木酮糖激酶活性提高；c.通过戊糖磷酸通路的通量提高；d.醛糖还原酶活性降低；e.对分解代谢物阻遏的敏感性降低；f.对乙醇、渗量或有机酸的耐性提高；或g.副产物的生产减少。3.根据权利要求2的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致至少一种下述基因的过表达，所述基因编码所述戊糖磷酸通路的非氧化部分的酶。4.根据权利要求3的细胞，其中所述基因是编码5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶或转醛酶的基因。5.根据权利要求3的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致至少编码转酮酶和转醛酶的基因过表达。6.根据权利要求2的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致编码木酮糖激酶的基因过表达。7.根据权利要求3的细胞，其中被过表达的所述基因是对所述细胞来说内源的基因。8.根据权利要求2的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致所述细胞中非特异性醛糖还原酶活性的降低。9.根据权利要求8的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰降低编码非特异性醛糖还原酶的内源基因的表达，或降低所述非特异性醛糖还原酶的活性。10.根据权利要求9的细胞，其中通过破坏所述基因使所述基因失活。11.根据权利要求9的细胞，其中通过缺失所述基因的至少部分使所述基因失活。12.根据权利要求9的细胞，其中所述细胞中编码非特异性醛糖还原酶的每种基因的表达被降低。13.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗·克莱斯森，简·米特斯卡·拉恩·范德，比安卡·伊丽莎白·玛丽亚·吉勒森，吉斯博蒂娜·皮特奈拉·苏勒库姆·范，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL