本发明专利技术公开了转基因斑马鱼模型在筛选治疗G6PD缺乏症的药物中的应用。该转基因斑马鱼模型是由红系细胞特异性启动子gata1驱动118‑144位点缺失的突变g6pd基因，同时也是表达EGFP的可示踪的转基因斑马鱼模型。该模型是通过显性负效应建立的葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶缺乏症（G6PDD）的斑马鱼模型用于筛选治疗G6PD缺乏症药物的过程中能可示踪的观察到药物处理过程中红细胞的变化以实现其应用。本发明专利技术获得了一种全新的筛选治疗G6PD缺乏症药物的便利方式，提高了药物筛选的效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种转基因斑马鱼模型在筛选治疗G6PD缺乏症的药物中的应用，属于基因工程
技术介绍
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症（gluocose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，简称G6PD 缺乏症）俗称蚕豆病，是世界上最常见的遗传性溶血性红细胞酶缺陷病。红细胞在成熟的过程中丧失了细胞核和核糖体，因而不能合成蛋白质，无法进行三羧酸循环。因此成熟的红细胞主要靠磷酸戊糖途径来提供能量。G6PD是磷酸戊糖代谢途径的限速酶。6-磷酸葡萄糖在G6PD的催化下产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)和5-磷酸核糖（ribose-5-phosphate，R5P）。NADPH对维持谷胱甘肽（glutathione,GSH）的还原状态从而保护红细胞免受氧化剂的损害极为重要。G6pd 基因突变导致G6PD 酶活性降低，会影响NADPH的产生。NADPH是机体多种物质合成代谢的供氢体，同时维持还原型谷胱甘肽（GSH 的还原状态） 的生成量。NADPH缺乏会减弱机体抗氧化剂（还原型谷胱甘肽GSH、过氧化氢H2O2）的抗氧化效果，使红细胞中的血红蛋白及红细胞膜在接触氧化性损伤时受到损害及发生溶血。目前全世界就G6PD 缺乏症发病的详细机制尚不清楚，有待进一步的研究探讨。常见临床表现包括新生儿黄疸、药物或感染造成的急性溶血、蚕豆病和先天性非球形细胞溶血性贫血（CNSHA）等。现今，对G6PD 缺乏症的治疗措施主要为早期筛查，避免诱发因素等预防治疗措施。一旦经确诊后的病例给予服禁用药物，避免诱发因紊。高胆红素血症予以蓝光照射、碱化血液、输白蛋白、输血等对症治疗，以及相关辅助治疗。国内外仍未有特异性治疗G6PD 缺乏症的治疗措施。Gata-1 是原始红系发育中的特异性的启动子，标记早期红系细胞。在24hpf,斑马鱼的血液循环开始建立时可检测到gata-1-egfp 标记的红细胞随循环流动。48h 之后gata-1 表达逐渐减少。所以利用gata-1 作为驱动突变的g6pd 基因的启动子可以使突变型g6pd 基因在红细胞中特异性表达。从而实现突变型g6pd基因在红细胞中表达的“可示踪”观察。目前并没有一种十分理想的动物实验模型可以很好的实现g6pd 基因的结构变化与功能之间关系的研究。目前，世界已报道400多种G6PD缺乏生化型和160多种G6PD基因突变类型。G6PD基因突变具有以下特点：多为单个碱基置换的错义突变，尚未发现整个基因或大片段基因的缺失，也未见无义突变及移码突变。中国人群中至少鉴定出31种点突变。1388G-A、1376G-T、1024C-T、1004C-T、871G-A和95A-T为中国人最常见的g6pd基因突变类型，其累计基因频率超过了86%。通过蛋白质比较，本课题组发现，人和斑马鱼的蛋白具有很高的相似性（相似度88%）。A95T是中国一个比较常见的突变位点，通过对蛋白质三维结构（PDB ID: 2BHL)的学习，发现在第32号氨基酸附近存在着以下二级结构：32-37号氨基酸是β折叠的区域，38-40号氨基酸是β转角的区域，40号氨基酸是NADP+的结合位点，42-46号氨基酸是α螺旋的区域[19]。通过和人的G6PD蛋白序列的比对，拟敲除斑马鱼G6PD的第40-48位氨基酸，即对斑马鱼G6PD基因序列118-144位置制造突变，通过分子生物学技术将突变型g6pd基因装入特定载体中，利用显微注射技术将目的质粒导入斑马鱼体内，实现显性负性效应，进而建立G6PD缺乏症的斑马鱼模型，从而进一步研究斑马鱼中g6pd的突变对其G6PD酶活性的影响，G6PD的结构及功能的变化导致红细胞受损的详细机制。为人类G6PD缺乏症的详细机制及大规模高通量药物筛选提供基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的主要技术问题是开发出由gata-1 启动子驱动的118-144位点突变g6pd基因与egfp基因的转基因斑马鱼模型，并提供该转基因斑马鱼模型的建立方法及该转基因斑马鱼模型在筛选治疗G6PD缺乏症药物的过程中的应用。本专利技术首先提出了一种转基因斑马鱼模型，该模型是由红系细胞特异性启动子gata1驱动118-144位点缺失的突变g6pd基因，同时也是表达EGFP的可示踪的转基因斑马鱼模型。这种由gata1启动子驱动g6pd突变基因与egfp基因表达的转基因斑马鱼模型的建立方法，包括以下步骤：1）将g6pdM118-144-egfp-PCS2+，gata-1-PBSK-Isce I质粒酶切连接构建了gata1-g6pdM118-144-egfp-PBSK-Isce I质粒。2）将gata1-g6pdM118-144-egfp-PBSK-Isce I质粒通过显微注射的方式注入1细胞期斑马鱼胚胎动物极胚盘内。3）通过观察24hpf期胚胎是否表达绿色荧光筛选出转基因的胚胎并孵化养至成鱼作为F0代转基因斑马鱼。4）以F0代转基因斑马鱼与野生型交配后产生的表达绿色荧光的胚胎孵化并养至成鱼作为F1代转基因斑马鱼。5）通过观察胚胎EGFP荧光情况和基因组PCR 法鉴定转入的g6pdM118-144-egfp基因的表达和插入情况。其中，步骤1）中的g6pd基因的突变位点是118-144位点，该位点是模拟人类G6PD缺乏症中95A-T突变所产生的效应。进一步的，这种由gata-1 启动子驱动g6pdM118-144突变基因和EGFP基因的转基因斑马鱼模式的应用主要是：该模型是通过显性负效应建立的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症（G6PDD）的斑马鱼模型用于筛选治疗G6PD缺乏症药物的过程中能可示踪的观察到药物处理过程中红细胞的变化。相比于传统的G6PD缺乏症动物模型，本专利技术具有如下优点：1.gata-1是原始红系发育中的特异性的转录因子，标记早期红系细胞。在24hpf，斑马鱼的血液循环开始建立，利用gata-1 作为驱动突变的g6pd 基因的启动子可以使突变型g6pd 基因在红细胞中特异性表达。2.gata1同时驱动g6pd与egfp基因，可实现突变型g6pd基因在红细胞中表达的“可示踪”观察。3.斑马鱼胚胎与成鱼通体透明，构建的该动物模型可以在显微镜下示踪胚胎和鱼体内荧光标记红细胞在药物诱导下的变化规律，为筛选治疗G6PD缺乏症的药物提供可视的动物模型。附图说明图1是gata1-g6pdM118-144-egfp转基因斑马鱼胚胎F1代幼鱼荧光表达鉴定情况。图1中：A-E分别是zgata1:g6pdM118-144-egfp发育至11.24.36.48.72小时的荧光图；F-J野生型斑马鱼对照；图2是基因组PCR鉴定结果。图2中：M:DNA mark 1.zgata1:g6pdM118-144-egfp 转基因系斑马鱼；2.WT；3.zgata1-egfp ；4.空白；图3是全胚胎原位杂交检测egfp鉴定转基因模型构建情况。图3中：A.zgata1:g6pdM118-144-egfp 转基因系斑马鱼；B.zgata1-egfp 转基因系斑马鱼；C. WT斑马鱼。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例本文档来自技高网...
【技术保护点】
转基因斑马鱼模型在筛选治疗G6PD缺乏症的药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.转基因斑马鱼模型在筛选治疗G6PD缺乏症的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的转基因斑马鱼模型在筛选治疗G6PD缺乏症的药物中的应用，其特征在于：该转基因斑马鱼模型是由红系细胞特异性启动子gata1驱动118-144位点缺失的突变g6pd基因，同时也是表达EGFP的可示踪的转基...
【专利技术属性】
技术研发人员：何志旭，舒莉萍，周艳华，夏海雄，宋锦，吴西军，杨燕，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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