一种G6PD缺乏症基因检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种G6PD缺乏症基因检测试剂盒，包括：①片段扩增引物及其复合扩增体系；②检测G6PD突变SNP位点的探针（分为特异探针和共用探针）；③还包括标签连接反应模板（包括特异外挂结合区和标签探针结合区）、标签探针（可带有不同荧光标记）、连接反应体系。本发明专利技术选择G6PD缺乏症的致病基因g6pd为检测对象，可直接对受测试者的基因型进行确诊，显著降低女性杂合子的漏诊率，测试准确性超过其他常规测试方法。另外，本发明专利技术的最短测试时间仅3小时，是一种高效、准确、操作简便的新型G6PD缺乏症诊断办法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物体外诊断
，具体涉及一种G6PD缺乏症基因检测试剂盒。
技术介绍
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydroge-nase,G6PD)缺乏症是全球最常见的一种遗传性X连锁不完全显性酶缺乏症。全球约4亿人罹患此病。G6PD基因位于X染色体，基因长约18Kb，有13个外显子和12个内含子，由515个氨基酸组成。我国是G6PD缺乏症高发区之一，呈南高北低的分布特点，患病率为0.2-44.8％。主要分布在长江以南各省，以海南、广东、广西、云南、贵州、四川等省为高。迄今全球已发现G6PD基因突变型126种，在我国发现过其中15种：1376G>T、1388G>A、95A>G、1311C>T、392G>T、1024C>T、592C>T、1004C>T、493A>G、487G>A、1360C>T、835A>T、1381G>A、1387G>T、871G>A。本专利技术选取了其中7种高致病型位点(1388G>A、1376G>T、1024C>T、1004C>T、871G>A、95A>G以及392G>T)进行检测。G6PD缺乏症发病原因是由于G6PD基因突变，导致G6PD酶活性降低，红细胞不能抵抗氧化损伤而遭受破坏，引起溶血性贫血。其临床表现与一般溶血性贫血大致相同。分新生儿黄疸、蚕豆病、药物性溶血、感染性溶血、非球形细胞溶血性贫血等临床类型。本病临床表现的轻重程度不同，多数患者，特别是女性杂合子，平时不发病，无自觉症状，部分患者可表现为慢性溶血性贫血症状。G6PD缺乏症同时也是新生儿病理性黄疸的主要原因。据中山医大的一项统计表明，患G6PD缺乏症的新生儿中，约50％的患儿会出现新生儿黄疸，其中约12％可发展为核黄疸，导致脑部损害，引起智力低下。G6PD基因定位于X染色体长臂2区8带(Xq28)，一旦发生突变，男性患者均表现为G6PD严重缺乏；女性患者拥有2条X染色体，若两条染色体都有G6PD基因缺陷，也表现为G6PD严重缺乏；若只有一条染色体G6PD基因缺陷，则临床表现变化很大，G6PD酶的活性可能从正常到完全缺乏，这将给检测带来极大的难度。多年来，G6PD缺乏症的检测方法在不断更新，目前主要有：四氮唑蓝纸片定性法、变性珠蛋白小体生成试验、高铁血红蛋白还原试验(MHb-RT)、荧光斑点法(FST)、G6PD活性测定等检测方法。这些方法操作简便、价格低廉，但是准确性不高，极易产生假阳性或假阴性，尤其在测试女性杂合子时，很容易发生漏诊。
技术实现思路
鉴于目前市面上G6PD缺乏症的检测方法普遍存在准确性低、高成本、操作复杂等缺点，本专利技术旨在提供一种准确性高、低成本、操作简便的检测试剂盒，以弥补现有检测方法容易漏诊女性杂合子的情况，帮助检出G6PD缺乏症携带者并对他们进行及时地治疗，为优生优育、提高国民身体素质做出一份贡献。本专利技术所采取的技术方案是：一种G6PD缺乏症基因检测试剂盒，其含有：用于特异性扩增G6PD基因上7个多态性位点的引物对、用于检测各多态性位点的探针、标签探针和标签连接反应模板；所述7个多态性位点为：1388、1376、1024、1004、871、95、392；所述用于检测各多态性位点的探针包括：共用探针、分型识别探针；所述分型识别探针包括野生型特异探针和突变型特异探针。G6PD基因上7个多态性位点对应的引物对如下表所示：所述分型探针从5’至3’端依次为多态性位点特异结合区、长度调整区，所述长度调节区是通过不同的序列长度来指示不同位点的不同基因型；所述共用探针从5’至3’端依次为外挂区、共用识别区，所述外挂区的作用是与标签连接反应模板右侧特异性结合。所述分型探针从5’至3’端依次为：外挂区、长度调整区、多态性位点特异结合区，所述外挂区的作用是与标签连接反应模板右侧特异性结合，所述长度调节区是通过不同的序列长度来指示不同位点的不同基因型；所述共用探针包括靶序列特异接合区。所述分型探针5’端第2-5位可以引入单碱基突变，或者是在探针序列中加入锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)修饰，以提高连接酶识别的特异性。所述用于检测各多态性位点的探针如下表所示：F代表上游共用探针，W代表野生型特异探针，M代表突变型特异探针。所述共用探针和分型识别探针进行5’磷酸化处理。所述标签连接反应模板是由两段人工序列组成的寡核苷酸序列，左侧部分作用是与标签探针特异结合，右侧部分是与共用探针或分型识别探针的外挂序列特异结合；所述标签探针是指用荧光染料标记的一段寡核苷酸序列，其作用是与标签连接反应模板中的左侧特异结合，所述荧光染料可以是FAM、HEX、TAMARA、ROX、Siz或vig。所述标签探针的序列如下所示：AGTGCCAGCAAGATCCAATCTCA；所述标签连接反应模板序列如下所示：tccaacccttagggaacccTGAGATTGGATCTTGCTGGCACT。所述试剂盒中还含有PCR复合扩增体系和连接反应体系。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术能够准确判别受检人员的基因型，明确他们是杂合突变或纯合突变。可降低漏诊杂合突变携带者的概率。(2)本专利技术中的PCR扩增体系，可以免除提取DNA的步骤，直接从血滤纸、FTA卡、唾液卡等检材上扩增出待测片段，省时省力。(3)基于高效特异多重连接反应进行的SNP检测准确性得到显著提高。(4)为了提高连接酶连接的特异性，本专利技术在特异探针的5’端第2至4个碱基处人为引入单碱基错配(如图3a所示)。人为引入单碱基错配的原则是：若5’端为中等错配(A-A，C-C，G-G，T-T)，则需引入中等错配，若5’端是强错配(G-A，T-C)则引入弱错配(G-T，A-C)；若5’端为弱错配，则引入强错配。同理，特异探针的3’端第2至4个碱基处也可以按照引入单碱基错配原则进行修饰(如图3b所示)，以提高连接酶连接的特异性。(5)多种荧光标签探针与毛细管电泳结合使用，一次电泳可以同时检测5位受检人员，检测效率高。附图说明图1是一种G6PD缺乏症基因检测试剂盒检测位点的排布图；图2是探针结构原理示意图，其中a是待测SNP位点位于共用探针5’末端时的原理示意图；b是待测SNP位点位于特异探针3’末端时的原理示意图；图3是人为引入单碱基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种G6PD缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：用于特异性扩增G6PD基因上7个多态性位点的引物对、用于检测各多态性位点的探针、标签探针和标签连接反应模板；所述7个多态性位点为：1388、1376、1024、1004、871、95、392；所述用于检测各多态性位点的探针包括：共用探针、分型识别探针；所述分型识别探针包括野生型特异探针和突变型特异探针。

【技术特征摘要】
1.一种G6PD缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：用于特异性扩增G6PD基因上7个多态性位点的引物对、用于检测各多态性位点的探针、标签探针和标签连接反应模板；所述7个多态性位点为：1388、1376、1024、1004、871、95、392；所述用于检测各多态性位点的探针包括：共用探针、分型识别探针；所述分型识别探针包括野生型特异探针和突变型特异探针。
2.根据权利要求1所述的G6PD缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，G6PD基因上7个多态性位点对应的引物对如下表所示：
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3.根据权利要求1所述的G6PD缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所述分型探针从5’至3’端依次为多态性位点特异结合区、长度调整区，所述长度调节区是通过不同的序列长度来指示不同位点的不同基因型；所述共用探针从5’至3’端依次为外挂区、共用识别区，所述外挂区的作用是与标签连接反应模板右侧特异性结合。
4.根据权利要求1所述的G6PD缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所述分型探针从5’至3’端依次为：外挂区、长度调整区、多态性位点特异结合区，所述外挂区的作用是与标签连接反应模板右侧特异性结合，所述长度调节区是通过不同的序列长度来指示不同位点的不同基因型；所述共用探针包括靶序列特异接合区。
5.根据权利要求1或3或4所述的G6PD缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所述分型探针5’端第2-5位...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑卫国，胡琦，王於建，杜蔚安，孟祥和，郭育林，葛海鹏，高静，王邦超，
申请(专利权)人：广东华美众源生物科技有限公司，无锡中德美联生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44