一种检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂，具有特异性强、敏感度高等优点，包括抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体和抗体稀释液；所述抗体稀释液由博士德生物技术有限公司生产，其商品货号为AR1016。本发明专利技术还公开了一种检测EGFRvⅢ的免疫组化方法：利用检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂，通过免疫组化方法检测待检测标本组织中的EGFRvⅢ的表达情况，检测结果可以作为临床医生的诊断依据之一，为临床肿瘤的诊断起预后判断的作用，帮助临床肿瘤的诊断、分类、预后判断以及疗效评估。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂及检测方法，属于肿瘤标志临床应用与研究领域。
技术介绍
表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)分子量为170kD，属于受体酪氨酸激酶的EbrB家族，由胞外区、跨膜区和胞内区组成，其正常活化可介导细胞的生长、增殖、分化、黏附以及移动等活动。许多上皮源性肿瘤与EGFR活性增加或异常有关。EGFR通常在人类不同肿瘤中过表达，而且EGFR的过表达与某些肿瘤的恶性程度相关。近年研究发现，在肿瘤的发生和发展过程中，EGFR蛋白的表达不是很稳定，常常出现基因的扩增和重排，导致基因突变使得肿瘤细胞表面的抗原表型发生调变。现研究发现EGFR存在3种胞外型突变体,即EGFRvⅠ、EGFRvⅡ和EGFRvⅢ,与这些突变的受体结合后的EGFR信号通路通常异常激活,引起细胞异常增殖。其中EGFRvⅢ是人类肿瘤中最为常见的突变形式。EGFRvⅢ与EGFR完整结构比较，EGFRvⅢ分子量为130kD，26个外显子中第2～7个外显子被删除，导致801个碱基对缺失，其删除端由一个新的甘氨酸密码子(GGT)连接，翻译成蛋白质后，胞外区6～273氨基酸被一个甘氨酸残基替代。丧失了胞外配体结合部位的EGFRvⅢ可在没有配体结合的情况下组成性激活酪氨酸激酶，产生自体磷酸化，诱发下游的信号转导途径，引起级联反应，影响肿瘤细胞的生物学行为。迄今为止，EGFRvⅢ尚未在正常组织中检出，被视为恶性肿瘤特异性表达的EGFR突变体，在脑胶质瘤(阳性率30～50％)、肺癌(阳性率39％)、乳腺癌(阳性率20～36％)、卵巢癌(阳性率75％)、头颈部癌(阳性率42％)、结肠癌(阳性率34％)、前列腺(阳性率100％)、肝癌(阳性率36.8％)、胃癌(阳性率35.2％))等均有发现。EGFRvⅢ只在肿瘤细胞中出现，而在正常组织细胞不表达，所以它是一种很好的肿瘤特异抗原，这使EGFRvⅢ成为一个很好的肿瘤治疗的靶标。EGFRvⅢ与肿瘤患者预后也有一定关系，肿瘤组织EGFRvⅢ的表达水平是判断预后的独立指征，EGFRvⅢ表达高者预后差。如何准确、快速的检测出各肿瘤组织EGFRvⅢ的表达情况是靶向免疫治疗的关键因素。目前，检测EGFRvⅢ的表达情况主要采用的方法有直接测序法、实时定量PCR法及组织免疫组化法等方法。这些方法各有优势，但存在操作复杂、耗时长、成本相对较大、特异性差等不足之处，尚有改进的必要。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂，以及检测方法。利用免疫组化法检测EGFRvⅢ在肿瘤的表达，EGFRvⅢ蛋白的阳性染色定位主要在细胞膜和细胞浆上，表现为棕黄色颗粒；结果采用半定量积分法，每张切片由2位阅片者在盲态情况下判读，此结果可以作为临床医生的诊断依据之一，为临床肿瘤的诊断起预后判断的作用，帮助临床肿瘤的诊断、分类、预后判断以及疗效评估。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂，包括抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体(抗体原液)和抗体稀释液；所述抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体，其制备方法记载在文献Oncotarget.2016Dec22.doi:10.18632/oncotarget.14088.中；所述抗体稀释液，主要成分为Tris缓冲液(pH7.2)，并含有NaN3和蛋白质，由博士德生物技术有限公司生产，其商品货号为AR1016，商品名称抗体稀释液。进一步地，所述抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体(抗体原液)与抗体稀释液的体积比为1:1～5000，优选1:1000～1:4000。一种检测EGFRvⅢ的方法(免疫组化法)，为：利用上述检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂，通过免疫组化方法检测待检测标本组织(为手术或穿刺的肿瘤组织经处理后得到)中的EGFRvⅢ的表达情况，检测结果可以作为临床医生的诊断依据之一，为临床肿瘤的诊断起预后判断的作用，帮助临床肿瘤的诊断、分类、预后判断以及疗效评估(具体实施治疗方案还需再参考患者的临床表现情况)。进一步地，所述检测结果为EGFRvⅢ的表达值，是通过以下免疫组化的评分方法得出的：EGFRvⅢ的表达值＝细胞膜染色强度分值×细胞膜染色分值+细胞质染色强度分值×细胞质染色分值。所述细胞膜染色强度分值为在细胞膜上染色强度的分值，所述细胞质染色强度分值为在细胞质上染色强度的分值；所述染色强度的分值打分依据为：未染色＝0，弱染色＝1，中等染色＝2，强染色＝3。所述细胞膜染色分值的打分依据为：细胞膜染色细胞数0％～5％对应的分值为0；细胞膜染色细胞数6％～25％对应的分值为1；细胞膜染色细胞数26％～50％对应的分值为2；细胞膜染色细胞数51％～100％对应的分值为3。所述细胞质分值的打分依据为：为细胞质染色细胞数0％～5％对应的分值为0；细胞质染色细胞数6％～25％对应的分值为1；细胞质染色细胞数26％～50％对应的分值为2；细胞质染色细胞数51％～100％对应的分值为3。当EGFRvⅢ的表达值在4分以上时，判断为“EGFRvⅢ表达为阳性”，当EGFRvⅢ的表达值小于4分时，判断为“EGFRvⅢ表达为阴性”(未染色、弱染色、中等染色、强染色的判断，细胞膜染色细胞数的判断，均是本领域技术人员所掌握的常规实验技能)。所述抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体是由北京大学医学部研制开发(本申请的申请人与其合作，参与研制开发；该抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体，相关内容已经发表文章，其文献信息为：Oncotarget.2016Dec22.doi:10.18632/oncotarget.14088.，分子量为150KD，为IgG2a亚型。该抗体是抗人EGFRvⅢ蛋白的小鼠单克隆抗体，可与组织细胞上的EGFRvⅢ抗原特异性结合，并与酶标羊抗小鼠免疫球蛋白聚合物识别并结合，通过免疫组织化学染色，使组织切片中抗原位点上出现黄色或棕黄色着色，使用光学显微镜可观察组织片中EGFRvⅢ的表达情况。本专利技术在抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体的基础上，经过实验筛选得到了效果最佳的抗体稀释液(研制出抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体后并不意味着其可以直接作为抗体试剂工作液进行应用，合适的抗体稀释液也是优质的免疫组化产品的关键)，开发出了EGFRvⅢ免疫组化抗体试剂工作液，其与野生型EGFR无交叉反应，具有特异性强、敏感度高等优点，为EGFRvⅢ的靶向治疗提供了良好的前提和基础。附图说明图1：抗体与不同抗体稀释液组合成工作液后免疫组化检测结果示意图，其中，a：博士德(AR1016)；b：北京中衫金桥(ZLI-9028)；c：福州迈新(ABD-0030)；d：丹麦Dako(K8007)。图中央下部的字为：F98EGFRvⅢ。图2：脑胶质瘤的免疫组化切片，其中，1：星形细胞瘤Ⅱ级；2：少突胶质细胞瘤Ⅱ级；3：间变性星形细胞瘤Ⅲ级；4：间变性少突胶质细胞瘤Ⅲ级；5：胶质母细胞瘤。图3：不同恶性级别的脑胶质瘤中EGFRvⅢ表达情况，其中，A：EGFRvⅢ表达与组织学类型；B：EGFRvⅢ表达与WHO分级。图4：EGFRvⅢ与ATRX，MIB1，IDH1R132，突变P53在胶质瘤中的表达的相关性。图5：抗EGFRvⅢ单克本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂，其特征在于：包括抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体和抗体稀释液；所述抗体稀释液由博士德生物技术有限公司生产，其商品货号为AR1016，商品名称抗体稀释液。

【技术特征摘要】
1.一种检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂，其特征在于：包括抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体和抗体稀释液；所述抗体稀释液由博士德生物技术有限公司生产，其商品货号为AR1016，商品名称抗体稀释液。2.根据权利要求1所述的检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂，其特征在于：所述抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1:1～5000。3.根据权利要求2所述的检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂，其特征在于：所述抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1:1000～4000。4.一种检测EGFRvⅢ的免疫组化方法，其特征在于：利用权利要求1～4中任一项所述的检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂，通过免疫组化方法检测待检测标本组织中的EGFRvⅢ的表达情况，得到检测结果。5.根据权利要求4所述的检测EGFRvⅢ的免疫组化方法，其特征在于：所述检测结果为EGFRvⅢ的表达值，是通过以下免疫组化的评分方法得出的：EGF...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈丽，王培培，马艳玲，宫喜魁，
申请(专利权)人：北京弘润天源生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11