一种检测MDS相关基因群的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一组用来筛查MDS相关基因突变的测序试剂盒以及后续的医学解读数据库。MDS相关基因群包括U2AF1、TP53等16个基因。测序试剂盒包括对MDS相关16个基因全部外显子进行扩增的多重PCR引物。本发明专利技术提供的筛查MDS基因突变的试剂盒具有检测效率高、突变基因覆盖面广、检出率高等优点；给出的医学解读报告具有准确、权威的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，进一步涉及筛查MDS相关基因突变的检测试剂盒及其医学解读数据库，具体涉及一种检测MDS相关基因群的检测试剂盒。
技术介绍
MDS(骨髓增生异常综合征)是一组起源于造血髓系定向干细胞或多能干细胞的异质性克隆性疾患，主要特征是无效造血和高危演变为急性髓系白血病，临床表现为造血细胞在质和量上出现不同程度的异常变化。其具体临床表现为贫血，可伴有感染或出血，部分病人可无症状。部分患者可有肝，脾，淋巴结轻度肿大，少数患者可有胸骨压痛，肋骨或四肢关节痛。血象可呈全血细胞减少，或任何一系及二系血细胞减少。1982年由FAB协作组建议确立病名，并将MDS分为五型：难治性贫血；难治性贫血伴环状铁粒幼细胞增多；难治性贫血伴原始细胞增多，转变中的难治性贫血伴原始细胞增多；慢性粒－单核细胞白血病。MDS发病率约10/10万～12/10万人口，多累及中老年人，50岁以上的病例占50％～70％，男女之比为2：1。MDS30％～60％转化为白血病。其死亡原因除白血病之外，多数由于感染，出血，尤其是颅内出血。MDS的病因尚不明确，推测是由于生物，化学，或物理等因素引起基因突变，染色体异常使某个恶变的细胞克隆性增生。业已公认，诱变剂如病毒，某些药物(如化疗药)，辐射(放疗)，工业反应剂(如苯，聚乙烯)以及环境污染等的可致癌作用，诱变剂可引起染色体的重排或基因重排，也可能只引起基因表达的改变导致MDS.MDS和急性白血病一样，是由一个异常的造血干细胞衍生的恶性克隆发展起来的“克隆性疾病”。主要累及髓系细胞，使骨髓粒，红及巨三系细胞无效病态造血，其凋亡细胞数量明显增加。目前检测MDS的方法主要涉及细胞形态、流式细胞学、细胞遗传学、分子生物学。其中分子生物学的实验方法主要有巢式PCR、一代测序等。PCR方法不能直观的得到具体的突变序列，而一代测序的方法受到测序通量的影响，无法一次性检测多个基因的全部外显子区域。而二代测序作为一种高通量的检测方法，可以一次性准确测量多个基因的外显子序列，使精准治疗成为可能。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种检测MDS相关基因群的检测试剂盒，以解决现有技术中MDS的诊断方法较为局限，缺乏从分子生物学的角度诊断MDS的依据。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术的MDS的诊断方法准确性较低。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种检测MDS相关基因群的检测试剂盒，该试剂盒包括以下16个基因：U2AF1，CEBPA，SF3B1，TP53，SETBP1，NRAS，NPM1，RUNX1，TET2，KRAS，IDH1，DNMT3A，ASXL1，JAK2，PTPN11，SRSF2上述16个基因，由85个热点突变组成，其突变位点为本领域常规的突变位点，较佳地包括了indel突变位点(插入或缺失引起的序列改变insertionordeletion，indel)、无义突变位点、拼接区突变位点或错义突变位点，更佳地本专利技术所述的16个基因外显子区域的热点突变如表1所示。表1热点突变列表本专利技术所述的16个基因外显子区域的热点突变可用于对MDS做出辅助诊断，本领域MDS常规的诊断方法有形态学、细胞遗传学和流式细胞学，本专利技术所述方法较佳地从分子生物学角度对MDS做出诊断。本专利技术提供一组检测本专利技术所述MDS相关基因外显子区域的多重PCR引物，所述引物的扩增范围包括16个与MDS相关基因的外显子区域，扩增得到的单个片段长度为250bp左右。利用本专利技术提供的多重PCR引物，结合二代测序技术，能够检测本专利技术所述突变基因群中的全部外显子区域。其中所述的二代测序试剂为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。本专利技术所述检测试剂盒更佳地还包括将检测对象中提取的基因组DNA制成可供测序使用的文库的试剂，该种试剂为本领域常规使用试剂，只要能够满足多重PCR对基因组DNA质量的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。本专利技术所述检测试剂盒较佳地还包括：dNTP溶液，DNA聚合酶，用于分离或纯化核酸的是Backman磁珠。本专利技术所述的样本为检测对象的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组DNA即可。所述检测样本较佳地为骨髓、血液、实体瘤样本中的一种或几种，优选地为骨髓样本。一种本专利技术所述试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：(1)利用本专利技术所述检测试剂盒抽提检测对象的骨髓，提取基因组DNA；(2)用多重PCR引物对基因组DNA中专利技术中所述16个MDS相关基因的外显子区域进行扩增；(3)将步骤(2)中扩增所得的片段制成可供IonTorrent测序平台测序的文库；(4)对步骤(3)中所得DNA文库进行测序，得到下机数据；(5)对(4)中的下机数据进行生物信息学分析，而后利用医学解读数据库进行解读做出诊断即可。以上各个步骤的具体操作方法详见试剂盒说明书。本专利技术所用的试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：利用本专利技术提供的可用于筛查MDS相关基因突变的基因群，结合高通量测序技术，可以实现在形态学和流式细胞学之外对MDS进行辅助诊断，特别是对于疾病预后做出评估和针对相关靶药的作用效果做出预判具有特殊的优势。本专利技术提供的用于筛查MDS相关基因突变的基因群的检测试剂盒具有检测效率高、检出率高等优点。具体实施方式以下将对本专利技术的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。材料和方法：在中国医学科学院血液病医院和协和华美医学诊断中心2015年10月至2016年7月诊断的患者中，根据以下标准，我们进行连续性入组(194名)。入选标准为：经细胞形态学和流式细胞学诊断为骨髓增生异常综合征(MDS)的患者。194名患者的诊断结果如表2所示：表2患者诊断结果列表收集3mL患者骨髓提取基因组DNA待测，该检测经过中国医学科学院血液病医院伦理委员会批准。样本处理：样本中基因组利用天根DNA提取试剂盒(货号：DP318-03)进行抽提，具体操作方法参见试剂盒的使用说明书。用多重PCR引物对基因组DNA进行扩增，实验操作方法参见Life公司试剂盒的使用说明书。文库的构建：对扩增得到的DNA片段使用Life公司生产的IonTorrent平台建库试剂盒进行测序文库的构建，实验操作方法参见Life公司试剂盒的使用说明书。高通量测序：将构建好的测序文库经油包水处理后在IonTorrent平台上进行高通量测序，油包水处理方法和高通量测序方法请参考高通量测序仪IonTorrent以及其配套设备OneTouch的使用说明书。生物信息学分析：首先，使用IonReport软件(v4.6,ThermoFisher,Carlsbad,CA,USA)过滤低质量的测序片段，并将合格的测序片段比对到人类参考基因组hg19(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html)，使用TorrentVariantCaller(v4.6.0.7)子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测MDS相关基因群的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下16个基因：U2AF1，CEBPA，SF3B1，TP53，SETBP1，NRAS，NPM1，RUNX1，TET2，KRAS，IDH1，DNMT3A，ASXL1，JAK2，PTPN11，SRSF2。

【技术特征摘要】
1.一种检测MDS相关基因群的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下16个基因：U2AF1，CEBPA，SF3B1，TP53，SETBP1，NRAS，NPM1，RUNX1，TET2，KRAS，IDH1，DNMT3A，ASXL1，JAK2，PTPN11，SRSF2。2.根据权利要求1所述的一种检测MDS相关基因群的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒还包括以上16个基因的引物，所述引物的扩增范围包括以上16个基因的全部外显子区域。3.根据权利要求2所述的一种检测MDS相关基因群的检测试剂盒，其特征在于所述外显子区域包括85个热点突变，所述85个热点突变及其与所述16个基因的对应关系如下表所示：4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾玉娇，寇坤元，张冬雷，李静，
申请(专利权)人：天津协和华美医学诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12