人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术揭示了一种人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒及方法，试剂盒包括SMN1主反应液，SMN2主反应液，酶混合液，0拷贝质控，SMN1单拷贝质控，SMN1两拷贝质控，SMN2单拷贝质控和SMN2两拷贝质控；SMN1主反应液中包括SMN1基因的检测引物和SMN1的内参引物；SMN2主反应液中包括SMN2基因的检测引物和SMN2的内参引物；试剂盒采用PCR熔解曲线法，通过实时检测双链DNA熔解过程中荧光信号值的变化，根据不同扩增产物量的差异，目的基因与内参基因生成不同溶解峰，再通过软件处理判断SMN1与SMN2基因的拷贝数；本发明专利技术检测结果准确性高，灵敏度高，检测耗时短，成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种分子生物学领域，尤其是涉及一种PCR方法检测人运动神经元存活基因SMN1和SMN2拷贝数的试剂盒及检测方法。
技术介绍
脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularalrophy，SMA)是一种常见的致死性神经肌肉疾病之一，是由于脊髓前角细胞运动神经元退化变性所导致的进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力瘫痪及萎缩为特征的遗传性神经肌肉疾病。SMA发病年龄可以从出生前到青春期，主要临床症状和体征包括对称性、进行性的累及四肢近端肌肉为主的肌力、肌张力下降和腱反射减弱或消失，下肢臀部和股部肌群萎缩无力，出现行走鸭步。严重者上肢近端肌肉无力，抬肩举肩困难。智力和感觉基本正常。常见的并发症有；体重减轻，失眠，吸入性肺炎，脊柱侧凸，关节挛缩等。SMA人群发病率约为1/6000～1/10000，杂合子频率高达1/40-1/60，是仅次于囊性纤维变性(cysticfibrosis)的第2位常见的常染色体隐性遗传病。根据患者的发病时间和临床症状(肌肉活动的最大程度和存活率)，SMA被分为I、II、III、IV4个类型，在4种SMA类型中，SMAI型为致命性，是位居世界儿童死亡率第一位的“杀手”(killer)。鉴于其严重性及给患者家庭带来的巨大悲痛，对SMA的科学研究一直受到国内外的高度重视。目前，多重连接探针扩增技术(Multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA)：其基本原理为特异性探针与靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增、产物毛细管电泳分离及数据收集、软件计算等分析靶序列拷贝数变异。每个MLPA探针包括2个寡核苷酸片段，每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，2个寡核苷酸片段都与相邻的靶序列进行杂交，之后使用连接酶进行连接。此连接反应高度特异，只有当靶序列与探针特异性完全互补时，连接酶才能将2段探针连接成一条完整的核酸单链；只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增信号，如果检测的靶序列发生点突变或缺失，那么相应探针的扩增峰便会降低或缺失。因此，根据扩增峰的改变就可以判断靶序列是否存在拷贝数的异常。PCR-DHPLC技术是一类在单核苷酸多态性(SNP)研究中常见的分析技术，具有成本低、检测快速、通量高的优点。其原理是在DNA链部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异判断是否存在DNA突变。在脊髓性肌萎缩症检测中，DHLPC分型的原理是通过将扩增产物洗脱峰形及峰高(面积)比例与参照样本比对，进而推测样本SMN基因的实际拷贝数。实践应用中，DHLPC的分辨力常受到实验设计、检测环境等诸多因素的影响，存在检测可靠性和稳定性欠佳的问题。因而该技术在SMA携带者中一般仅用于初级筛查，诊断结果常需辅以其他方法进行验证。实时荧光定量PCR技术：定量PCR方法分析SMN基因拷贝数，目前已衍生出多种SMA携带者的检测方法，如SYBRGreenI染料法。FeldkotterM等将一个SMN1∶SMN2＝2∶0的参照样本梯度稀释，模拟不同SMN1拷贝数的标准品，并通过未知样本与标准品荧光Cp值的拟合判断样本的实际拷贝数；SolovivoOO等则通过引入ALB内参基因，并依照相对定量算法2-△△Ct(Livakmethod)计算样本的SMN1基因拷贝数。荧光染料实时定量PCR法的应用大幅度提升了检测的易操作性，为大规模携带者的筛查提供了可能。但是SYBRGreenI等荧光染料本身无序列特异性，无法区分扩增产物与引物二聚体及非特异产物产生的荧光信号差异。目标基因与内参基因的扩增效率差异是否稳定符合2-△△Ct相对定量算法的数学基础也是有待验证，因而该方法在携带者检测中的可靠性尚值得商榷。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒及检测方法，以提高检测的灵敏度、结果的的准确性、检测的效率，从而降低成本。为实现上述目的，本专利技术提出如下技术方案：一种人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，包括：SMN1主反应液、SMN2主反应液、酶混合液、0拷贝质控、SMN1单拷贝质控、SMN1两拷贝质控、SMN2单拷贝质控和SMN2两拷贝质控；所述SMN1主反应液中包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN1基因的检测引物和用于检测人运动神经元存活基因SMN1的内参引物；所述SMN1基因的检测引物的序列为：正向引物：TCCTTACAGGGTTTCAGAC(SMN1-FP)，反向引物：AACCTTTCAACTTTTTAACAT(SMN1-RP)；所述SMN1基因的内参引物序列为：正向引物：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT(CFTR-FP)，反向引物：CTCTATTTTAGACATCAAAA(CFTR-RP)；所述SMN2主反应液中包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN2基因的检测引物和用于检测人运动神经元存活基因SMN2的内参引物；所述SMN2基因的检测引物序列为：正向引物：TCCTTACAGGGTTTTAGAC(SMN2-FP)，反向引物：AACCTTTCAACTTTTTAACAT(SMN2-RP)；所述SMN2基因的内参引物序列为：正向引物：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT(CFTR-FP)，反向引物：CTCTATTTTAGACATCAAAA(CFTR-RP)。优选地，所述SMN1主反应液包括40m～60mMTris，1mM～3mMMgCl2，400mg～600mg/LBSA，dNTPs，450nM～550nMSMN1-FP，450nM～550nMSMN1-RP，450nM～550nMCFTR-FP，450nM～550nMCFTR-RP，50×Syto9和超纯水。优选地，所述SMN1主反应液包括50mMTris，2mMMgCl2，500mg/LBSA，dNTPs，500nMSMN1-FP，500nMSMN1-RP，500nMCFTR-FP，500nMCFTR-RP，50×Syto9和超纯水。优选地，所述SMN2主反应液包括40m～60mMTris，1mM～3mMMgCl2，400mg～600mg/LBSA，dNTPs，450nM～550nMSMN2-FP，450nM～550nMSMN2-RP，450nM～550nMCFTR-FP，450nM～550nMCFTR-RP，50×Syto9和超纯水。优选地，所述SMN2主反应液包括50mMTris，2mMMgCl2，500mg/LBSA，dNTPs，500nMSMN2-FP，500nMSMN2-RP，500nMCFTR-FP，500nMCFTR-RP，50×Syto9和超纯水。优选地，所述酶混合液包括1U/TestDNA聚合酶和1U/TestAnti-taq抗体。优选地，所述0拷贝质控为含有CFTR基因序列的质粒；所述SMN1单拷贝质控和所述SMN1两拷贝质控为含有SMN1基因序列的质粒与含CFTR基因序列的质粒混合液；所述SMN2单拷贝质控和所述SMN2两拷贝质控含有SMN2基因序列的质粒与含CFTR基因序列的质粒混合液。本专利技术的人运动神经元存本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，其特征在于，包括：SMN1主反应液，SMN2主反应液，酶混合液，0拷贝质控，SMN1单拷贝质控，SMN1两拷贝质控，SMN2单拷贝质控和SMN2两拷贝质控；所述SMN1主反应液中包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN1基因的检测引物和用于检测人运动神经元存活基因SMN1的内参引物；所述SMN1基因的检测引物的序列为：正向引物：TCCTTACAGGGTTTCAGAC，反向引物：AACCTTTCAACTTTTTAACAT；所述SMN1基因的内参引物序列为：正向引物：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT，反向引物：CTCTATTTTAGACATCAAAA；所述SMN2主反应液中包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN2基因的检测引物和用于检测人运动神经元存活基因SMN2的内参引物；所述SMN2基因的检测引物序列为：正向引物：TCCTTACAGGGTTTTAGAC，反向引物：AACCTTTCAACTTTTTAACAT；所述SMN2基因的内参引物序列为：正向引物：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT，反向引物：CTCTATTTTAGACATCAAAA。...

【技术特征摘要】
1.一种人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，其特征在于，包括：SMN1主反应液，SMN2主反应液，酶混合液，0拷贝质控，SMN1单拷贝质控，SMN1两拷贝质控，SMN2单拷贝质控和SMN2两拷贝质控；所述SMN1主反应液中包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN1基因的检测引物和用于检测人运动神经元存活基因SMN1的内参引物；所述SMN1基因的检测引物的序列为：正向引物：TCCTTACAGGGTTTCAGAC，反向引物：AACCTTTCAACTTTTTAACAT；所述SMN1基因的内参引物序列为：正向引物：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT，反向引物：CTCTATTTTAGACATCAAAA；所述SMN2主反应液中包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN2基因的检测引物和用于检测人运动神经元存活基因SMN2的内参引物；所述SMN2基因的检测引物序列为：正向引物：TCCTTACAGGGTTTTAGAC，反向引物：AACCTTTCAACTTTTTAACAT；所述SMN2基因的内参引物序列为：正向引物：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT，反向引物：CTCTATTTTAGACATCAAAA。2.根据权利要求1所述的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，其特征在于，所述SMN1主反应液包括40m～60mMTris，1mM～3mMMgCl2，400mg～600mg/LBSA，dNTPs，450nM～550nMSMN1-FP，450nM～550nMSMN1-RP，450nM～550nMCFTR-FP，450nM～550nMCFTR-RP，50×Syto9和超纯水。3.根据权利要求2所述的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，其特征在于，所述SMN1主反应液包括50mMTris，2mMMgCl2，500mg/LBSA，dNTPs，500nMSMN1-FP，500nMSMN1-RP，500nMCFTR-FP，500nMCFTR-RP，50×Syto9和超纯水。4.根据权利要求1所述的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，其特征在于，所述SMN2主反应液包括40m～60mMTris，1mM～3mMMgCl2，400mg～600mg/LBSA，dNTPs，450nM～550nMSMN2-FP，450nM～550nMSMN2-RP，450nM～550nMCFTR-FP，450nM～550nMCFTR-RP，50×Syto9和超纯水。5.根据权利要求4所述的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，其特征在于，所述SMN2主反应液包括50mMTris，2mMMgCl2，500mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小舟，倪晓龙，张炳为，苗保刚，李明，彭年才，
申请(专利权)人：苏州天隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32