水稻微卫星标记位点开发方法与微卫星标记位点内的微卫星标记的长度检测方法技术

本发明专利技术公开了一种水稻微卫星标记位点开发方法与微卫星标记位点内的微卫星标记的长度检测方法。所述开发方法包括：获得混合样本；提取混合样本的基因组；将基因组片段化，获得基因组片段；利用探针组分别与基因组片段进行杂交；纯化多个杂交溶液中成功杂交的基因组片段；将多个所述纯化的杂交基因组片段混合后，利用高通量测序检测所述纯化的基因组片段；获得有效的所述高通量测序片段；将所述有效的高通量测序片段进行分类。所述检测方法包括：选择待检测的微卫星标记位点；利用多重扩增引物扩增所述待检测的微卫星标记位点内的微卫星标记，获得所述微卫星标记位点内的微卫星标记的长度。上述方法简单、快速、全面且准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种水稻微卫星标记位点开发方法与微卫星标记位点内的微卫星标记的长度检测方法。
技术介绍
微卫星标记又称短串联重复序列(shorttandemrepeats，STR)或简单重复序列(simplesequencerepeats，SSR)，指由2个以上核苷酸为重复单元串联重复构成。微卫星标记位点指的是在基因组上含有微卫星标记的座位，微卫星标记位点在基因组上数量丰富且均匀分布，微卫星标记位点的开发指的是寻找基因组上的微卫星标记位点的过程。不同样本中，同一个微卫星标记位点内的微卫星标记的重复单元的重复次数可能不同，在样本间存在长度变异，因此微卫星标记位点的多态性主要指同一个微卫星标记位点的不同微卫星标记的长度多态性。微卫星标记检测技术指的是检测微卫星标记位点中的微卫星标记的长度的技术。不同样本的微卫星标记的长度多态性可以用来对样本的身份进行鉴定，因此，微卫星标记技术的应用十分广泛，包括生物多样性鉴定、动植物品种指纹身份证鉴定等等。传统的水稻微卫星标记位点的开发与检测包括以下步骤：基因组提取、基因组片段化、连接接头、扩增、与简单重复序列杂交、纯化杂交产物、杂交产物克隆、克隆产物大肠杆菌转化、挑取单克隆、对每一个单克隆的目标位点进行一代测序、分析测序结果获得微卫星标记位点、在多个水稻样本中检验微卫星标记位点的多态性、开发出多态性高的微卫星标记位点、逐一扩增并电泳检测每一个待检测的样品中的每一个待检测的微卫星标记位点中的微卫星标记。在实现本专利技术的过程中，专利技术人发现现有技术至少存在以下问题：水稻微卫星标记位点的开发与检测流程复杂、通量低、极其耗时费力；其次，微卫星标记位点的电泳检测的分辨率低，检测结果不准确，准确的结果需要参考样本等进行校正。由此派生的问题包括：开发出来的微卫星标记位点少，通常200个以内，占基因组上所有微卫星标记位点的1％左右；用于检验微卫星标记位点多态性的水稻样本也少，通常在数十个左右，因此多态性检证结果不准确；微卫星标记位点的侧翼序列保守性未知，影响扩增微卫星标记位点的引物的通用性；检测的微卫星标记位点的数量有限，一般在一个待检测的样品中检测数十个微卫星标记位点，导致建立的样本的DNA身份证信息不完整、不准确。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本专利技术实施例提供了一种水稻微卫星标记位点开发方法与微卫星标记位点内的微卫星标记的长度检测方法。所述技术方案如下：一方面，本专利技术实施例提供了一种水稻微卫星标记位点开发方法，所述方法包括：将n个具有多态性的水稻样本等质量混合，获得混合样本，其中n＞1；提取所述混合样本的基因组；将所述混合样本的基因组片段化，获得基因组片段；将多个具有简单重复序列的探针作为探针组，利用所述探针组中的每个探针分别与所述基因组片段进行杂交，获得多个杂交溶液，对多个所述杂交溶液中成功杂交的基因组片段分别进行纯化，得到多个纯化的杂交基因组片段；将多个所述纯化的杂交基因组片段等质量混合后，利用高通量测序检测混合后的所述纯化的杂交基因组片段，获得第一高通量测序片段；从所述第一高通量测序片段中，筛选有效的所述高通量测序片段，所述有效的高通量测序片段包括微卫星标记位点内的微卫星标记；根据所述有效的高通量测序片段中的微卫星标记的两侧序列的同源性对所述有效的高通量测序片段进行分类，同一类的所述有效的高通量测序片段为同一个微卫星标记位点的所述有效的高通量测序片段，若同一个所述微卫星标记位点的所述有效的高通量测序片段的条数≥α1，则成功开发一个所述微卫星标记位点，其中，α1为第一判定阈值且α1≥(高通测序深度×有效的高通量测序片段的比例/基因组上能检测到的微卫星标记位点数)×概率保证。通常，为了便于纯化所述杂交溶液中成功杂交的基因组片段，可以对探针进行功能化标记，例如可以利用生物素标记的具有简单重复序列的探针与所述基因组片段进行杂交，获得杂交溶液；利用链霉亲和素磁珠纯化所述杂交溶液中成功杂交的基因组片段，获得纯化的基因组片段。在上述步骤中由于探针具有生物素标记，使得成功杂交的基因组片段也被生物素标记，从而可以利用链霉亲和素磁珠从所述杂交溶液中纯化出来。所述利用生物素标记和链霉亲和素磁珠纯化的技术为公知技术。具体地，α1≥20。具体地，所述微卫星标记指由≥2个碱基组成的重复单元串联重复构成的序列。具体地，所述有效的高通量测序片段中的所述微卫星标记的两侧序列的碱基数均≥1个，且所述有效的高通量测序片段中的所述微卫星标记中至少有一侧的序列的碱基数≥10个。具体地，选择所述n个具有多态性的样本的方法包括：选择外部形态不同的水稻样本、生物分类不同的水稻样本、标记互不相同的水稻样本或不同生态区域的野生资源的水稻样本。具体地，所述探针的数量为12个，每个所述探针的简单重复序列中的重复单元为CT、GA、TG、AC、TA、TGT、CCA、ATC、CCT、AGA、ATG或CAA，每个所述探针的简单重复序列的重复次数为6～20，优选为6～15，例如重复次数为8或12。具体地，所述探针的序列如序列表中SEQINNO:1-SEQINNO:12所示。另一方面，本专利技术实施例提供了一种上述开发方法成功开发的微卫星标记位点内的微卫星标记的长度检测方法，所述检测方法包括：从成功开发的所述微卫星标记位点中，选择待检测的微卫星标记位点；利用多重扩增引物扩增所述待检测的微卫星标记位点内的微卫星标记，得到扩增产物，将所述扩增产物进行高通量测序，得到第二高通量测序片段，通过分析所述第二高通量测序片段，获得所述微卫星标记位点内的微卫星标记的长度。具体地，所述从成功开发的所述微卫星标记位点中，选择所述待检测的微卫星标记位点的方法包括：选择所述待检测的微卫星标记位点的标准为H值最大的所述微卫星标记位点，其中，H值为所述微卫星标记位点的多态性指数，其中，i为按所述微卫星标记位点的所述有效的高通量测序片段中的微卫星标记的长度进行分类时，第i个类别，i为自然数；ai为第i个类别的有效的所述高通量测序片段的数目占总的有效的所述高通量测序片段的数目的比例。具体地，制备所述多重扩增引物的方法包括：从选择的所述待检测的微卫星标记位点的所有所述有效的高通量测序片段中，提取所述微卫星标记并挑选出最长的所述微卫星标记作为多重扩增引物的模版序列的微卫星标记；从选择的所述待检测的微卫星标记位点的所有所述有效的高通量测序片段中，提取所述微卫星标记的左侧序列并挑出长度大于α2个碱基的所有序列，从挑选出的所述所有序列中，挑选出频率最高的序列，以所述频率最高的序列作为参考序列，将所述参考序列与所有的所述微卫星标记的左侧序列进行比对，在所述频率最高的序列中获得每一个碱基的覆盖倍数和变异频率；在所述频率最高的序列中，将所述覆盖倍数≤1/α3或所述变异频率≥α3的碱基变为N后作为所述多重扩增引物的模板序列的左侧序列，其中，N为A、T、C和G四种碱基中任意一种及以上的碱基；α2为第二判定阈值，α2＝(所述第一高通量测序片段的平均长度-所述多重扩增引物的微卫星标记位点的长度)÷2；α3为第三判定阈值，α3≥5×(1-所述第一高通量测序片段的准确度)；按照与所述多重扩增引物的模板序列的左侧序列相同的方法，获得多重扩增引物序列的模板序列的右侧序列；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻微卫星标记位点开发方法，其特征在于，所述开发方法包括：将n个具有多态性的水稻样本等质量混合，获得混合样本，其中n＞1；提取所述混合样本的基因组；将所述混合样本的基因组片段化，获得基因组片段；将多个具有简单重复序列的探针作为探针组，利用所述探针组中的每个探针分别与所述基因组片段进行杂交，获得多个杂交溶液，对多个所述杂交溶液中成功杂交的基因组片段分别进行纯化，得到多个纯化的杂交基因组片段；将多个所述纯化的杂交基因组片段等质量混合后，利用高通量测序检测混合后的所述纯化的杂交基因组片段，获得第一高通量测序片段；从所述第一高通量测序片段中，筛选有效的所述高通量测序片段，所述有效的高通量测序片段包括微卫星标记位点内的微卫星标记；根据所述有效的高通量测序片段中的微卫星标记的两侧序列的同源性对所述有效的高通量测序片段进行分类，同一类的所述有效的高通量测序片段为同一个微卫星标记位点的所述有效的高通量测序片段，若同一个所述微卫星标记位点的所述有效的高通量测序片段的条数≥α1，则成功开发一个所述微卫星标记位点，其中，α1为第一判定阈值且α1≥(高通测序深度×有效的高通量测序片段的比例/基因组上能检测到的微卫星标记位点数)×概率保证。...

【技术特征摘要】
1.一种水稻微卫星标记位点开发方法，其特征在于，所述开发方法包括：将n个具有多态性的水稻样本等质量混合，获得混合样本，其中n＞1；提取所述混合样本的基因组；将所述混合样本的基因组片段化，获得基因组片段；将多个具有简单重复序列的探针作为探针组，利用所述探针组中的每个探针分别与所述基因组片段进行杂交，获得多个杂交溶液，对多个所述杂交溶液中成功杂交的基因组片段分别进行纯化，得到多个纯化的杂交基因组片段；将多个所述纯化的杂交基因组片段等质量混合后，利用高通量测序检测混合后的所述纯化的杂交基因组片段，获得第一高通量测序片段；从所述第一高通量测序片段中，筛选有效的所述高通量测序片段，所述有效的高通量测序片段包括微卫星标记位点内的微卫星标记；根据所述有效的高通量测序片段中的微卫星标记的两侧序列的同源性对所述有效的高通量测序片段进行分类，同一类的所述有效的高通量测序片段为同一个微卫星标记位点的所述有效的高通量测序片段，若同一个所述微卫星标记位点的所述有效的高通量测序片段的条数≥α1，则成功开发一个所述微卫星标记位点，其中，α1为第一判定阈值且α1≥(高通测序深度×有效的高通量测序片段的比例/基因组上能检测到的微卫星标记位点数)×概率保证。2.根据权利要求1所述的开发方法，其特征在于，α1≥20。3.根据权利要求1所述的开发方法，其特征在于，所述有效的高通量测序片段中的所述微卫星标记的两侧序列的碱基数均≥1个，且所述有效的高通量测序片段中的所述微卫星标记中至少有一侧的序列的碱基数≥10个。4.根据权利要求1所述的开发方法，其特征在于，选择所述n个具有多态性的水稻样本的方法包括：选择外部形态不同的水稻样本、生物分类不同的水稻样本、标记互不相同的水稻样本或不同生态区域的野生资源的水稻样本。5.根据权利要求1所述的开发方法，其特征在于，所述探针的数量为12个，每个所述探针的简单重复序列中的重复单元为CT、GA、TG、AC、TA、TGT、CCA、ATC、CCT、AGA、ATG或CAA，每个所述探针的简单重复序列的重复次数为6～20；优选地，每个所述探针的简单重复序列的重复次数为6～15。6.根据权利要求1所述的开发方法，其特征在于，所述探针的序列如序列表中SEQINNO:1-SEQINNO:12所示。7.一种权利要求1-6任一项所述的开发方法成功开发的微卫星标记位点内的微卫星标记的长度检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：从成功开发的所述微卫星标记位点中，选择待检测的微卫星标记位点；利用多重扩增引物扩增所述待检测的微卫星标记位点内的微卫星标记，得到扩增产物，将所述扩增产物进行高通量测序，得到第二高通量测序片段，通过分析所述第二高通量测序片段，获得所述微卫星标记位点内的微卫星标记的长度。8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述从成功开发的所述微卫星标记位点中，选择待检测的微卫星标记位点的方法包括：选择所述待检测的微卫星标记位点的标准为H值最大的所述微卫星标...

【专利技术属性】
技术研发人员：周俊飞，彭海，李论，方治伟，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42