一种猪衣原体的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种猪衣原体的检测方法，包含以下步骤，A、样品制备，采取疑似患病猪的血液样本，B、DNF提取，本发明专利技术猪衣原体的检测方法通过摸索选用了优化后的实时荧光定量PCR反应条件和扩增体系，提高了检测的特异性和敏感性，建立了TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR检测猪衣原体的方法，并将其固相化集成快速检测试剂盒，敏感性为10fg的总DNA，同时不与沙眼衣原体55Y120株、肺炎衣原体AR39株、沙眼衣原体、肺炎衣原体、牛结核分枝杆菌、布鲁士杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乳链球菌、肺炎克雷伯杆菌和沙门氏菌发生交叉反应，具有较强的特异性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测方法，具体是一种猪衣原体的检测方法。
技术介绍
衣原体是介于细菌和病毒之间的一类微生物,直径0.2μm～1.5μm,它只能在寄主细胞原生质内部以一种发育史进行繁殖。此发育史是以小的原体变成较大的网状体为特征的,网状体以分裂方式繁殖,网状体发育成熟后破裂,释放出大量的原体。原体具有感染性,网状体对新的宿主细胞未见感染性。猪衣原体革兰氏染色呈阴性。细胞壁的结构和成分与其他革兰氏阴性菌相似,但只有微量或无胞壁酸。猪衣原体病主要是由鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydiapsittaci)感染猪引起的一种多征候性传染病,临床表现为怀孕母猪流产、早产和产出生命力弱的仔猪；仔猪肺炎、肠炎、心包炎、脑膜脑炎、多关节炎和结膜炎；公猪睾丸炎等症状。其中猪衣原体性流产和引起仔猪大批死亡的衣原体性肺炎-肠炎对集约化养猪业危害严重。猪衣原体(Chlamydophilapsittaci，Cps)是一类专性细胞内寄生的人兽共患病病原体，能引起人和动物多种疾病。Cps对鸟类、家禽和家畜有很强的感染性，可引起禽类的肺炎、气囊炎、输卵管炎及受精率降低和哺乳动物流产、死产等生殖系统障碍，是一类十分重要的自然疫源性传染病，呈地方流行。猪衣原体病是由猪衣原体感染牛引起的一种多症状性传染病，主要表现为妊娠母牛流产、死产和产弱犊；新生牛多发生肺炎、肠炎、多发性关节炎、脑炎和结膜炎；种公牛发生睾丸炎等，对奶牛养殖业造成很大危害及经济损失。目前针对猪衣原体疾病的检测主要通过检测病原体是否存在来作为主要依据，常用的有碘和Giemsa染色，免疫荧光法，根据抗原抗体的酶免疫技术以及灵敏度比较高的PCR技术。然而针对PCR反应，目前主要体现在MOMP基因、rRNA基因和内源性质粒这三个目的片段，内源性质粒的敏感性和特异性高于MOMP基因、rRNA基因的检测，能够检测敏感性达1fg的质粒DNA，rRNA基因能够检测到10fg的总DNA，MOMP基因的敏感性却为100fg的总DNA，为此我们建立基于TaqMan探针的RealtimePCR技术，针对MOMP基因中的ompA(majoroutermembraneproteinA，ompA)基因建立快速的、高灵敏的PCR检测试剂盒，从而为猪衣原体感染检测提供强有力的技术保障。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪衣原体的检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种猪衣原体的检测方法，包含以下步骤，A、样品制备，采取疑似患病猪的血液样本，B、DNF提取，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取猪衣原体的DNA，将提取后的DNA置于-70℃保存备用，C、引物及探针设计；D、PCR；E、灵敏度检测；F、特异性检测。作为本专利技术进一步的方案：包含以下步骤，先用引物，其中，涉及的引物如下：根据GenBank中牛猪衣原体主要外膜A蛋白ompA基因序列，利用Primer5.0软件设计引物，上游序列为4′-CGTACCATGTGGGAAGGTGCTTG-3′，下游序列为4′-CGCATTTGGAGAGGATCCTGTG-3′，针对引物之间的基因片段利用PrimerExpress设计TaqMAN探针，序列为4′-GCGCAGGATACTACGGAGATTATG-3′，4’：端标记FAM，3’端标记NFQ-MGB，扩增目标片段的长度为150bp。作为本专利技术进一步的方案：涉及的主要PCR方法：PremixExTaqTM(ProbeqPCR)10.0μL；PCRForwardPrimer(10uM)0.8μL；PCRReversePrimer(10uM)0.8μL；Probe1.0μL；总DNA2.0μL；ddH2O5.4μL；总体系20μL。反应条件为95℃预变性30s；95℃5s，62℃20s，72℃20s，40个循环；最后37℃降温20min，至反应结束。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术猪衣原体的检测方法通过摸索选用了优化后的实时荧光定量PCR反应条件和扩增体系，提高了检测的特异性和敏感性，建立了TaqManMGB探针法实时荧光定量PCR检测猪衣原体的方法，并将其固相化集成快速检测试剂盒，敏感性为10fg的总DNA，同时不与沙眼衣原体55Y120株、肺炎衣原体AR39株、沙眼衣原体、肺炎衣原体、牛结核分枝杆菌、布鲁士杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乳链球菌、肺炎克雷伯杆菌和沙门氏菌发生交叉反应，具有较强的特异性。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。一种猪衣原体的检测方法，包含以下步骤，A、样品制备，采取疑似患病猪的血液样本，B、DNF提取，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取猪衣原体的DNA，将提取后的DNA置于-70℃保存备用，C、引物及探针设计；D、PCR；E、灵敏度检测；F、特异性检测。作为本专利技术进一步的方案：包含以下步骤，先用引物，其中，涉及的引物如下：根据GenBank中牛猪衣原体主要外膜A蛋白ompA基因序列，利用Primer5.0软件设计引物，上游序列为4′-CGTACCATGTGGGAAGGTGCTTG-3′，下游序列为4′-CGCATTTGGAGAGGATCCTGTG-3′，针对引物之间的基因片段利用PrimerExpress设计TaqMAN探针，序列为4′-GCGCAGGATACTACGGAGATTATG-3′，4’：端标记FAM，3’端标记NFQ-MGB，扩增目标片段的长度为150bp。涉及的主要PCR方法：PremixExTaqTM(ProbeqPCR)10.0μL；PCRForwardPrimer(10uM)0.8μL；PCRReversePrimer(10uM)0.8μL；Probe1.0μL；总DNA2.0μL；ddH2O5.4μL；总体系20μL。反应条件为95℃预变性30s；95℃5s，62℃20s，72℃20s，40个循环；最后37℃降温20min，至反应结束。本专利技术的工作原理是：本专利技术涉及的敏感性检测显示：标准菌株总DNA进过稀释，最大DNA浓度为1μg，最小DNA浓度为1fg，每个样3次重复，结果显示1fg的总DNA在两台仪器中都无扩增曲线，说明最大灵敏度为总DNA10fg。两台仪器都显示出良好的标准曲线，IQ5仪器的相关系数R2＝0.996，LightCycler的相关系数R2＝0.0.993，溶解曲线峰值单一，IQ5仪器的Tm＝74.3℃，LightCycler的Tm＝74.1℃。肺炎衣原体AR39株采用细胞培养分离，提取总DNA，并且进行梯度稀释，采用TaqMan定量PCR上级分析，结果显示阳性猪衣原体10fg以上的总DNA都显示出特异性扩增曲线，并且溶解曲线单一，Tm＝74.1。沙眼衣原体、肺炎衣原体、沙眼衣原体、肺炎衣原体、牛结核分枝杆菌、布鲁士杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乳链球菌、肺炎克雷伯杆菌和沙门氏菌均为典型阴性反应，均未见特异性的荧光扩增曲线，均无荧光值增长。结果表明，所建立的猪衣原体TaqManMGB探针实时荧光定量PCR检测方法具有较强的特异性。本专利技术涉及的样品检测显示：针对食用猪肉样本，采用猪衣原体IHA诊断试剂盒检测，PCR和RT-Q本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪衣原体的检测方法，其特征在于，包含以下步骤，A、样品制备，采取疑似患病猪的血液样本，B、DNF提取，用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取猪衣原体的DNA，将提取后的DNA置于‑70℃保存备用，C、引物及探针设计；D、PCR；E、灵敏度检测；F、特异性检测。

【技术特征摘要】
1.一种猪衣原体的检测方法，其特征在于，包含以下步骤，A、样品制备，采取疑似患病猪的血液样本，B、DNF提取，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取猪衣原体的DNA，将提取后的DNA置于-70℃保存备用，C、引物及探针设计；D、PCR；E、灵敏度检测；F、特异性检测。2.根据权利要求1所述的一种猪衣原体的检测方法，其特征在于，所述引物及探针设计包含以下步骤，先用引物，其中，涉及的引物如下：根据GenBank中牛猪衣原体主要外膜A蛋白ompA基因序列，利用Primer5.0软件设计引物，上游序列为4′-CGTACCATGTGGGAAGGTGCTTG-3′，下游序列为4′-CGCATTTGGAGAGGATCCTGTG-3′，针对引物之间的基因片段利用P...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋韦艳，刘金杰，吴敏芳，徐静，赵春城，胡勇，朱倩倩，
申请(专利权)人：无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32