本发明专利技术提供一种ＨＣＶ抗原检测板及用该板检测ＨＣＶ抗原的方法，将纯化的抗ＨＣＶ多克隆抗体按常规稀释至５－５０μｇ／ｍｌ，按５０－２００μｌ／孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，４℃过夜，洗板；再在聚苯乙烯板的孔中，按１００－３００μｌ／孔的量加入常规牛血清白蛋白封闭检测板，２－８℃过夜，洗板，晾干，２－８℃保存，得ＨＣＶ抗原检测板；再用该ＨＣＶ抗原检测板，并以长臂生物素标记的单（多）克隆ＨＣＶ－ＩｇＧ，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，或者用辣根过氧化物酶标记的单（多）克隆ＨＣＶ－ＩｇＧ作为放大系统，检测丙型肝炎病毒抗原。可减少检测步骤，缩短检测时间，并可通过降低交叉反应而降低背景，提高检测灵敏度，是一种特异性高、灵敏度高，操作简便、快捷的丙型肝炎病毒抗原检测方法，为ＨＣＶ感染的早期诊断、大规模快速筛查、定量检测等提供一条可靠的技术路径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种病毒抗原的检测方法，尤其是丙型肝炎病毒HCV抗原的检测方 法，属于生物
技术介绍
目前，丙型肝炎的检测方法主要有三类第一类是丙型肝炎抗体检测其缺点是感染丙型肝炎病毒HCV后，有2 沈周的 潜伏期，一般到抗HCV抗体出现(转阳)有一个较长的窗口期，平均为70d，有的患者窗口 期可延长至6-9个月或更长，约1-3%的患者抗HCV可持续阴性，在丙氨酸氨基转移酶升高 后，抗HCV抗体才上升。由于窗口期的存在，对潜伏期和隐形感染者容易造成漏检，机体感 染HCV后，在抗HCV抗体出现之前约2周左右，血循环中即可出现病毒颗粒，此时丙型肝炎 病毒HCV的RNA经PCR方法检测可为阳性，血液具有感染性，而用抗体检测方法根本无法测 出。另外该方法无法区分携带感染是急性期还是慢性期，或是既往感染痊愈后HCV抗体在 体内的长期存在。此外，少数因免疫缺陷或免疫系统发育未成熟患者的HCV抗体检测表现 为阴性，导致丙型肝炎病毒HCV感染者的漏检；由于厂家之间使用HCV基因重组抗原质量及 各抗原片段包被比例的不同，各厂家试剂间的灵敏度和特异性存在着一定差异，从而导致 抗HCV抗体检测结果不一致，易产生假阳性或漏检等情况。第二类是丙型肝炎病毒HCV核酸检测感染丙型肝炎病毒HCV后1-2周，血清中即 可检测到HCV-RNA。因此，HCV核酸检测(HCV RT-PCR检测)可用于丙型肝炎的早期诊断，并 且通过对病毒拷贝数的定量检测可对其临床疗效进行监测。HCV-RNA的存在是病毒复制的 直接标志，提示血液中有HCV存在，可以缩短感染后血清阳转前的检测窗口期，以实现HCV 感染的早期诊断，是诊断丙型肝炎病毒HCV的金标准。但是HCV-RNA在达到峰值或重新出 现前数天或数周内偶尔也可能检测不到。在向慢性转化的大多数感染者中，HCV-RNA含量 逐渐降低，最后趋于稳定，晚期肝病患者的HCV-RNA水平很低，甚至无法测出。HCV-RNA易 被血细胞中的RNA酶降解，因此如果被检标本保存不当(例如反复冻融)将影响检测结果； HCV-RNA还受进食的影响，因食物中的某些成分易与血中脂质及脂蛋白结合，从而降低检出 率。因此在一定程度上影响了核酸扩增检测方法的进一步完善。因为PCR法检测HCV-RNA 影响因素较多，在样本收集、储存和检测方面都有严格的要求，并且PCR的检测操作过程复 杂、费时，需要经过认证的PCR实验室和用特殊的检测仪器才能完成，且试剂盒价格昂贵， 因此在一些基层实验室难以推广应用，在大量筛查献血者血液质量方面受到相当的局限。第三类是丙型肝炎抗原检测丙型肝炎病毒HCV核心抗原是由HCV基因中最为 保守的部分编码而来，在HCV-RNA出现后的1 2d内即出现丙型肝炎病毒HCV抗原，且与 HCV-RNA的水平相平行，可以作为HCV复制的标志。血清中HCV抗原的检测有利于HCV感染 患者的早期发现，特别是某些免疫功能紊乱、免疫功能低下的患者和某些不产生抗体的携 带者。有研究表明，HCV抗原检测与抗HCV抗体检测相比，HCV抗原的检测可使检测的窗口 期平均提前49天，缩短窗口期HCV感染者的献血的风险。与RT-PCR方法相比具有操作简便、时间短、对环境要求低的特点，在临床上可用于早期急性丙型肝炎诊断、抗HCV阳性感 染者的病毒血症分析以及HCV感染者治疗前后病毒血症追踪分析。根据文献检索，目前报道的丙型肝炎病毒HCV抗原检测法主要是使用单克隆抗体 的双抗体夹心法，主要检测HCV核心抗原。该方法是以抗HCV核心抗原单克隆抗体作为固 相包被物，用与固相包被物有不同抗原决定簇的抗HCV核心抗原单克隆抗体作为辣根过氧 化物酶标记物这一系统。但由于HCV核心抗原是HCV结构区抗原的一部分，而血清中可存 在游离的保守性相对较高非结构蛋白NS3，这可能是造成目前HCV抗原检出率低的原因之 一。有文献报道，现有的HCV核心抗原检测试剂盒由于检出率较低尚不适合作临床丙型肝 炎的筛选，但可作为HCV抗体检测的进一步验证，可部分替代HCV-RNA检测。针对目前丙型肝炎病毒核心抗原检出率较低的现状，如果能对非结构区抗原进行 联合检测，就有可能提高HCV抗原的检出率。
技术实现思路
为解决现有丙型肝炎病毒核心抗原检出率较低的问题，本专利技术提供一种灵敏度 高，特异性好的HCV抗原检测板。本专利技术的另一个目的是提供一种灵敏度高，特异性好，操作简便、快捷的用HCV抗 原检测板检测丙型肝炎病毒抗原的方法，以应用于丙型肝炎病毒的科研、临床检验及对众 多献血者的筛查。本专利技术的第一个目的通过下列技术方案完成一种HCV抗原检测板，其特征在于 将纯化的抗HCV多克隆抗体按常规稀释至5-40 μ 1/ml，按100 μ 1/孔的量加入到聚苯乙烯 板的孔中，2-8°C过夜，洗板；再在聚苯乙烯板的孔中，按150 μ 1/孔的量加入常规牛血清白 蛋白封闭检测板，4°C过夜，洗板，晾干，2-8°C保存，即得HCV抗原检测板。所述纯化的抗HCV多克隆抗体经过下列方法制得A、抗HCV血清的制备Al、取浓度为512-lOMEu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原NS3、NS4、 NS5、C的等量混合液ι-aiii，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价 检测，效价未达1 4000时，须进行加强免疫注射；A3、当抗HCV血清效价大于1 8000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清， 得到抗HCV血清，-600C以下保存待用；B、抗HCV抗体的纯化Bi、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡30分钟，用5个柱体积的常规平衡 液进行平衡；B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至Bl的蛋白 A或蛋白A/G亲和层析柱上，用10个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用10个柱体积的 磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS 透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体。本专利技术所述HCV抗原检测板具体经过下列方法制得A、抗HCV血清的制备Al、取浓度为512-lOMEu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原N&、NS4、 NS5、C的等量混合液ι-aiii，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价 检测，效价未达1 4000时，须进行加强免疫注射；A3、当抗HCV血清效价大于1 8000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清， 得到抗HCV血清，-600C以下保存待用；B、抗HCV抗体的纯化Bi、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡30分钟，用5个柱体积的常规平衡 液进行平衡；B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至Bl的蛋白 A或蛋白A/G亲和层析柱上，用10个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用10个柱体积的 磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS 透析过夜，收集透析液，即 得纯化的抗HCV多克隆抗体；C、HCV抗原检测板包被Cl、将B2所得纯化的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＨＣＶ抗原检测板，其特征在于：将纯化的抗多表位ＨＣＶ多克隆抗体按常规稀释至５－５０μｇ／ｍｌ，按５０－２００μｌ／孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，２－８℃过夜，洗板；再在聚苯乙烯板的孔中，按１００－３００μｌ／孔的量加入常规牛血清白蛋白封闭检测板，２－８℃过夜，洗板，晾干，２－８℃保存，即得ＨＣＶ抗原检测板。
【技术特征摘要】
1.一种HCV抗原检测板，其特征在于将纯化的抗多表位HCV多克隆抗体按常规稀释 至5-50 μ g/ml，按50-200 μ 1/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，2_8°C过夜，洗板；再在聚 苯乙烯板的孔中，按100-300μ1/孔的量加入常规牛血清白蛋白封闭检测板，2-8°C过夜， 洗板，晾干，2-8°C保存，即得HCV抗原检测板。2.如权利要求1所述的HCV抗原检测板，其特征在于所述纯化的抗HCV多克隆抗体经 过下列方法制得A、抗HCV血清的制备Al、取浓度为512-10MEu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原NS3、NS4、NS5、 C的等量混合液1-lOml，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价检 测，效价未达1 4000时，须进行加强免疫注射；A3、当抗HCV血清效价大于1 4000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清，得到 抗HCV血清，-20 0C以下保存待用；B、抗HCV抗体的纯化Bi、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡10-60分钟，用2_10个柱体积的常规平 衡液进行平衡；B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至Bl的蛋白A或 蛋白A/G亲和层析柱上，用5-20个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用5-20个柱体积的 磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS 透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体。3.一种用权利要求1所述HCV抗原检测板检测丙型肝炎病毒抗原的方法，其特征在于 经过下列步骤A、在权利要求1所述的HCV抗原检测板的孔中，先加入样品缓冲液50-200μ 1/孔，再 加入待检样品50-200μ 1/孔，同时加入抗原阳性、阴性对照各2-3孔，设空白调零孔1孔， 之后放入湿盒中，37°C保温0. 5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3_8次；B、在A的检测板的孔中先加入生物素标记的HCV抗体使用液100-300μ 1/孔，放入湿 盒中，37°C保温0. 5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3_8次；再在检测板的孔...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢忠平，李琦涵，龙润乡，李华，杨蓉，白惠珠，董承红，蒋蕊鞠，易红昆，崔萍芳，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]
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