【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种轮状病毒mrna疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
1、人轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿腹泻最主要的病原体之一，在全球5岁以下的婴幼儿中，每年大约有1.14亿急性胃肠炎病例是由轮状病毒引起的，大约20万婴幼儿死于轮状病毒腹泻，占全球5岁以下儿童死亡病例的5%。目前尚无特效疗法，接种疫苗是防治轮状病毒感染和胃肠炎的有效策略。目前全球共有七款在售轮状病毒减毒活疫苗，包括美国的单价人轮状病毒减毒活疫苗rotarix（g1p）和人-牛轮状病毒重配株的口服五价减毒活疫苗rotateq（g1p,g2p,g3p, g4p, g6p1a）、中国兰州生物制品所研发的减毒活疫苗 “罗特威”（llr株，g10p）和rotalan（llr3，g2p、g3p和g4p），越南的人轮状病毒减毒活疫苗rotavin-m1（g1p），印度的人牛重配轮状病毒减毒活疫苗rotavac（g9p）和人-牛重配株brv-tv轮状病毒活疫苗rotasill（g1-g4,g9）。这些疫苗均为减毒活疫苗。使用减毒轮状病毒疫苗确实在人群中起到了一定的保护作用，但疫苗在制备、使用和免疫后的排毒使病毒在环境中长期存活、存在安全性隐患，包括外源因子污染、毒力返祖、肠套叠的风险等。因此，继续优化rv减毒活疫苗，或者开发替代rv减毒活疫苗的非复制型轮状病毒疫苗，包括灭活疫苗、重组亚单位疫苗等，对进一步降低rv导致的发病率和死亡率具有重要意义。
2、mrna疫苗是继传统疫苗（灭活疫苗、减毒活疫苗）和新型疫苗（亚单位疫苗、病毒载体疫苗）之后的第三
3、轮状病毒是属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是一种无包膜的双链 rna 病毒。基因组不连续，由11个分节段的双链rna组成，编码6个结构蛋白(vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7)和6个非结构蛋白(nsp1、nsp2、nsp3、nsp4、nsp5和nsp6。结构基因 vp7编码的vp7蛋白，与结构蛋白vp4一起构成了轮状病毒结构的最外层。两种衣壳蛋白vp7和vp4均具有中和表位，在病毒进入和感染靶细胞中起到重要作用，常被用作轮状病毒基因工程疫苗的候选基因。糖蛋白vp7蛋白是轮状病毒的结构性中和抗原，能诱导产生 igg 抗体，与免疫保护有关。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的是提供一种轮状病毒mrna疫苗及其制备方法和应用，以解决
技术介绍
中存在的问题。
2、为实现以上目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术构建的如seq id no：1所示的mrna脱氧核苷酸序列在制备轮状病毒mrna疫苗中的应用。
4、进一步的，本专利技术提供如seq id no：2所示的蛋白在制备轮状病毒mrna疫苗中的应用， seq id no：2所示的蛋白由seq id no：1所示的序列转录、翻译获得。
5、作为一些实施方式，本专利技术还提供了一种重组载体，包含如seq id no：1所示的核苷酸序列。
6、优选的，所述的重组载体，载体骨架为puc57-kan-sapi-free。
7、进一步的，所述的重组载体在制备轮状病毒mrna疫苗中的应用。
8、作为另一些实施方式，本专利技术提供一种轮状病毒mrna疫苗的制备方法，包括以下步骤：
9、s1：构建seq id no：1所示的vp7-mrna序列；
10、s2：构建含vp7-mrna序列的质粒；
11、s3：将质粒提取后进行酶切线性化，完成后进行磁珠纯化，获得纯化后mrna；
12、s2：将纯化后mrna溶解至乙酸乙酸钠缓冲液中，并与lnp制剂混合获得mrna-lnp混合剂；
13、s3：将mrna-lnp混合剂在ph 7.5this-hcl缓冲盐水中超滤100倍体积，然后过滤获得轮状病毒mrna疫苗。
14、进一步的，vp7-mrna序列包含轮状病毒自身5′utr 、t7启动子位点、cds区、3′utr2β-globin 和poly a尾，所述5′utr序列如seq id no：3所示。
15、优选的，步骤s2中，lnp制剂是由可电离脂质：dspc：胆固醇：peg-脂质按照摩尔比50：10：38.5：1.5的比例溶解在乙醇获得的制剂。
16、优选的，乙酸乙酸钠缓冲液的ph 为5.5，浓度为50 mmol/l。
17、作为一种更具体的实施方式，本专利技术提供了一种试剂盒，含上述任一所述的制备方法获得的轮状病毒mrna疫苗。
18、本专利技术达到的技术效果：
19、目前mrna疫苗设计多采用β珠蛋白5′和3′utr序列进行mrna疫苗设计，本研究利用自主分离的轮状病毒野毒株的自身utr序列进行轮状病毒mrna疫苗设计，并对vp7序列进行优化设计，分析加帽修饰后的mrna转染细胞后，能顺利表达vp7蛋白。
20、本专利技术设计了一种编码g1p型轮状病毒vp7蛋白、脂质纳米颗粒（lnp）包裹的mrna疫苗然后分别以2μg, 5μg和10μg，通过肌肉注射和皮下注射两种免疫途径免疫小鼠，两针或三针免疫后，分别进行体液免疫和细胞免疫水平评价。vp7 mrna疫苗能够诱导的rv特异性抗体和t细胞免疫应答的水平。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列在制备轮状病毒mRNA疫苗中的应用。
2.SEQ ID NO：2所示的蛋白在制备轮状病毒mRNA疫苗中的应用，其特征在于，SEQ IDNO：2所示的蛋白由SEQ ID NO：1所示的序列转录、翻译获得。
3.一种重组载体，其特征在于，包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，载体骨架为pUC57-Kan-SapI-free。
5.根据权利要求3或4所述的重组载体在制备轮状病毒mRNA疫苗中的应用。
6.一种轮状病毒mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，VP7-mRNA序列包含轮状病毒自身5′UTR 、T7启动子位点、CDS区、3′UTR 2β-globin 和poly A尾，所述5′UTR序列如SEQ ID NO：3所示。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，LNP制剂是由可电离脂质：DSPC：胆固醇：PEG-脂质按照摩尔
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，乙酸乙酸钠缓冲液的pH 为5.5，浓度为50 mmol/L。
10.一种试剂盒，其特征在于，含权利要求6-9任一所述的制备方法获得的轮状病毒mRNA疫苗。
...【技术特征摘要】
1.如seq id no：1所示的核苷酸序列在制备轮状病毒mrna疫苗中的应用。
2.seq id no：2所示的蛋白在制备轮状病毒mrna疫苗中的应用，其特征在于，seq idno：2所示的蛋白由seq id no：1所示的序列转录、翻译获得。
3.一种重组载体，其特征在于，包含如seq id no：1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，载体骨架为puc57-kan-sapi-free。
5.根据权利要求3或4所述的重组载体在制备轮状病毒mrna疫苗中的应用。
6.一种轮状病毒mrna疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
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【专利技术属性】
技术研发人员：周艳，李鸿钧，鲁晨星，吴晋元，胡晓青，陈蓉，林晓晨，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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