本发明专利技术公开了一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，包括包被有HCV嵌合抗原及HCV单克隆抗体的微孔板、样品稀释液、HCV抗原抗体联合检测酶工作液、HCV抗体酶工作液、HCV抗原酶工作液、底物A液、底物B液、20倍浓缩洗涤液及终止液。本发明专利技术同时公开了本试剂盒中关键组份如HCV嵌合抗原及HCV单克隆抗体的微孔板、样品稀释液、酶工作液的稀释液的配制及其使用。本发明专利技术公开的试剂盒及其检测方法既可以同时检测HCV抗原和抗体，也可以单独检测丙型肝炎早期、急性感染期及在抗体产生之前或已经形成抗原-抗体复合物时HCV抗原的情况，或单独检测抗体产生后HCV抗体的情况，可用于HCV的早期检测及治疗评价，为指导临床提供重要的检测评价指标。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属免疫检测
，具体来说涉及一种丙型肝炎病毒(HCV)抗原抗体联合检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染而引起的一种的全球性传染病。据估计，目前全世界有1.7亿丙肝病毒感染者，我国的丙肝感染率大约为3.2%，目前至少有4000 - 6000万丙肝患者。丙型肝炎的慢性化发生率明显高于乙型肝炎，且较乙型肝炎易早期出现肝硬化，导致肝癌，病死率较高，尤其是HCV的早期诊断对于筛查HCV的传染源、指导临床治疗和预后判断有重大意义。因此，有必要寻找一种简易的、准确的、价格低廉的和可以普遍推广的方法来实现对HCV的检测，对发展中国家尤其如此。HCV病毒属于黄病毒科，其基因组为单股RNA，约9.4kb，易变异。HCV基因组由一个大的开放阅读框(ORF)组成，编码10余种结构和非结构(NS)蛋白。编码一个3010?3033氨基酸的多聚蛋白，排列顺序为5' UTR-C2—El—E2—NS2—NS3—NS4—NS5—UTR,其中C为核心蛋白，El和E2为囊膜蛋白，NS为非结构蛋白.NS5B蛋白是RNA依赖RNA聚合酶，为HCV复制所需，是抗病毒治疗的重要靶位。在开放阅读框上游有一个341个核苷酸的5’UTR区域是所有HCV基因型的基因组中最为保守的区域，不同基因型具有90%的相似性，已成为HCV分子诊断技术的研究焦点。目前丙型肝炎的主要检测方法均有一定局限性:1、丙型肝炎抗体检测:是现在使用最广泛的检测方法，但其缺点一是存在“窗口期”，HCV感染后至抗HCV抗体产生之前还有一段约40 - 70天的较长时期(平均66天)，此时，献血员已被感染并具有感染性，应用目前的抗体检测试剂不能检出，该阶段称为感染后血清阳转前的窗口期(perseroconversion window phase, PWP).PWP的存在是输血安全的重要威胁之一，使受血者依然有经输入抗HCV筛选阴性的血液而感染HCV的危险。目前丙型肝炎的输血后感染占肝炎病例的70%，而在丙型肝炎感染者中更有80-90%是属于输血后感染，这在很大程度上鉴于上述原因。2,HCV RNA检测:主要用于抗病毒治疗的选择与疗效监测，但它需严格按PCR操作规程操作，检测人员需经专业培训并取得相应资质，且样本的质量控制要求高，要求采血后2小时内低温条件下送检，无菌抽提RNA，容易因仪器、试剂、人员及环境等造成误差，产生假阳性及假阴性。3、丙肝抗原检测:在HCV RNA出现后的l_2d内即出现丙型肝炎病毒HCV抗原，且与HCV RNA的水平相平行，可以作为HCV复制的标志。有研究表明，HCV抗原检测与抗体检测相比，HCV抗原的检测可使检测的窗口期平均提前49天，缩短窗口期HCV感染的风险。丙肝抗原抗体联合检测试剂盒可用于HCV的血源筛查同时检测丙肝抗原及抗体，既可提高用血及输血安全，同时也提高了工作效率及节约成本；此外本试剂盒及其检测方法可区分是HCV现症感染还是既往感染，可用于HCV的早期检测及治疗评价，为指导临床提供重要的检测评价指标。目前针对丙肝抗原抗体联合检测的相关专利如下:(I)丙型肝炎病毒抗原抗体时间分辨免疫荧光分析法联合检测及检测试剂盒(申请号:201210385472.4)。(2)酶免疫分析法直接标记抗原检测丙型肝炎病毒抗原抗体及检测试剂盒(申请号:201210391183.5)。(3)化学发光法直接标记抗原检测丙型肝炎病毒抗原抗体及检测试剂盒(申请号:201210376965.1)。(4) 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测的方法(申请号:200810143274.0)。(5) Methods for the simultaneous detection of HCV antigens andHCVantibodies(PCT/US02/19958).上述专利均提出了丙肝抗原抗体联合检测的方法，并均提出采用互相不反应的HCV单克隆抗体及HCV重组抗原作为包被原料，可实现丙肝抗原抗体联合检测的目的。其中申请号为201210385472.4,201210391183.5和201210376965.1的专利分别提出了可以采用时间分辨免疫荧光分析法、酶免疫分析法和化学发光法进行检测，但对如何实施的具体方法未详细介绍。申请号为200810143274.0的专利介绍了如何制备用于包被和检测的HCV单克隆抗体和HCV嵌合抗原及检测步骤，并提到了 8条引物，并对这8条引物及由此制备的HCV单克隆抗体和HCV嵌合抗原进行了保护，但也未详细介绍如何制备试剂盒的具体方法。美国专利PCT/US02/19958详细的介绍了制备用于包被和检测的HCV单克隆抗体和HCV嵌合抗原，并设计了 37条不同的引物，制备出多个HCV单克隆抗体和HCV嵌合抗原，组合出数十个可用于联合检测的抗原及抗体组合，并提到了一种丙肝抗原检测样品稀释液，详细说明了其配制方法及效果。但在上述专利的基础上仍有以下问题未解决:1、包被问题:因同时将相对应的抗原和抗体包被于微孔板上即使互相之间不反应，便因一蛋白会覆盖住另一蛋白或占优势，而使其中的另一种捕获能力大大减弱，使丙肝抗原抗体同时检测的目标大大受到影响。再由于蛋白包被于微孔板上主要靠疏水键、离子键等。同时包被抗原及抗体由于二者等电点相差远，很难做到二者均足够量且稳定的包被于微孔上。虽然上述专利均有介绍包被方式，但均仍是传统的单一物种蛋白的包被方式，无法做到二者兼顾。美国专利PCT/US02/19958对其每一种组合原料的使用均介绍了其包被方式，但其介绍的方法均为在微球上包被，再将不同的微球组合使用的方式，没有提到如何将同种的抗原和抗体同时包被于聚苯乙烯微孔板这种固相载体上的方式。2、丙肝抗体在血液中含量多，且丙肝抗体检测因用于检测的核心区抗原有很强的体内或体外的同源及异源结合能力，易引起本底高直至假阳性(Mastumoto，Μ.等，Virology, 218:P43-51,1996 ；KunkeI,Μ.等，Virology, 294:Ρ239-245，2002 ；Majeau,N.等，Journal of General Virology, 85:P971_981, 2004)。因此用检测丙肝抗体时用的样本量要求非常少，目前常见丙肝抗体检测试剂盒中样本量一般为IOul ;而丙肝抗原在血液中含量非常少，检测样本是对样本量的要求非常多，目前常见丙肝抗原检测试剂盒中样本量一般为lOOul。因此二者同时检测时对样本量要求上存在一定矛盾。由于患者在感染丙肝病毒品约一段时间后(平均49天)会产生抗体，形成抗原抗体免疫复合物，当产生抗原抗体免疫复合物后，因游离的抗原减少，使丙肝抗原的检出率大大降低。虽然美国专利PCT/US02/19958介绍了一种丙肝抗原样品稀释液，从它的专利中可以看出它可以使抗原的检出率大大提高。但是它含有大量的去垢剂和蛋白变性剂，如它例举的一种释释液的组合为0.1M ρΗ7.2的PB，0.0lM EDTA，0.5M NaCL, 2%SB_16,1.10%CTAB, 1.8%Triton-xl00,2.5M Urea, 1%BSA, 2%mouse seru本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，包含如下组份：包被有HCV嵌合抗原及HCV单克隆抗体的微孔板、样品稀释液、酶工作液、底物A液、底物B液、20倍浓缩洗涤液及终止液，其特征在于：所述微孔板制备时用含有离子表面活性剂和还原剂的包被缓冲液包被，其中离子表面活性剂选自十二烷基氨基丙酸、十二烷基二甲基胺乙内酯或溴化十六烷基三甲基铵（CTAB），还原剂选自半胱氨酸、二硫苏糖醇（DTT）、还原型谷胱甘肽或β?巯基乙醇，所述样品稀释液是含有还原剂、小鼠IgG和蛋白沉降剂硫酸铵的溶液，其中还原剂选自半胱氨酸、二硫苏糖醇（DTT）、还原型谷胱甘肽或β?巯基乙醇，所述酶工作液是包含有HCV抗原抗体联合检测酶工作液、HCV抗原检测酶工作液和HCV抗体检测酶工作液的三个独立包装。
【技术特征摘要】
1.一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，包含如下组份:包被有HCV嵌合抗原及HCV单克隆抗体的微孔板、样品稀释液、酶工作液、底物A液、底物B液、20倍浓缩洗涤液及终止液，其特征在于:所述微孔板制备时用含有离子表面活性剂和还原剂的包被缓冲液包被，其中离子表面活性剂选自十二烷基氨基丙酸、十二烷基二甲基胺乙内酯或溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)，还原剂选自半胱氨酸、二硫苏糖醇(DTT)、还原型谷胱甘肽或β-巯基乙醇，所述样品稀释液是含有还原剂、小鼠IgG和蛋白沉降剂硫酸铵的溶液，其中还原剂选自半胱氨酸、二硫苏糖醇(DTT)、还原型谷胱甘肽或β-巯基乙醇，所述酶工作液是包含有HCV抗原抗体联合检测酶工作液、HCV抗原检测酶工作液和HCV抗体检测酶工作液的三个独立包装。2.根据权利要求1所述丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于:所述离子表面活性剂为溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)，使用浓度为0.01wt%?1.3wt% ;所述还原剂为二硫苏糖醇(DTT)，使用浓度为0.01wt%?2wt%。3.根据权利要求2所述丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于:所述离子表面活性剂为溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)，使用浓度为0.08wt%?0.5wt% ;所述还原剂为二硫苏糖醇(DTT)，使用浓度为0.05wt%?1.0wt%。4.根据权利要求2所述丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于:所述离子表面活性剂为溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)，使用浓度为0.lw...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱之炜，吕红娟，欧兰香，王佳颖，陈振，王岩，寇宗阳，丁兴龙，
申请(专利权)人：山东莱博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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