一种感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株制造技术

本发明专利技术涉及一种感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株。本发明专利技术人首次成功地直接从丙肝患者血清中构建包含丙型肝炎病毒1b型结构基因的嵌合重组病毒。本发明专利技术为针对特定丙型肝炎病毒株的侵入、装配、中和抗体、药物和疫苗的研究提供了非常有用的工具和方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术以及病毒学领域；更具体地，本专利技术涉及一种感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株及其制备方法。 
技术介绍
全球丙型肝炎病毒(HCV)感染率约3%，慢性HCV感染会导致终末期肝病，包括肝硬化，肝衰竭及肝癌。至今尚无疫苗。目前标准的治疗方案包括聚乙二醇化干扰素α和利巴韦林联用，一些针对HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的小分子抑制剂也被开发出来。疗效与多因素有关，包括病毒及宿主因子，如病毒基因型，病毒载量及宿主在IL28B基因附近的单核苷酸多态性。 HCV属于黄病毒科，是有包膜的单股正链RNA病毒。其基因组长9.6kb，包括一个5’非翻译区(5’UTR)，开放读码框及3’非翻译区(3’UTR)。其开放读码框编码一个多聚蛋白，经剪切后得到结构蛋白(core，E1，E2)、p7及非结构蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)(Bartenschlager,R.等，2004.Advances in virus research63:71-180)。由于HCV病毒复制速率很快，它的依赖于RNA的RNA聚合酶保真度也不高，HCV的基因及抗原异质性很高，可分为6个主要的基因型及很多亚型。基因型之间在核酸水平的序列差异超过30%，亚型之间的差异约20-25%。而且，同一亚型的不同临床分离株之间的序列差异也有约5-8%。在中国，日本和欧洲，基因型1b是最常见的。由于不同基因型在核酸和蛋白水平有很多差异，它们在临床治疗上的差异也不足为奇：基因型1b对干扰素治疗最不敏感，持续病毒学应答仅50%。同时，HCV在体内又以准种形式存在，所谓准种，即许多在序列上高度同源但又有差异的HCV变异株病毒群体，对丙型肝炎病程进展及治疗效果也有影响。 HCV领域的发展曾经因为缺乏体外培养模型而受到很大的阻碍。在基于2a基因型的JFH-1的感染细胞培养模型建立后，研究人员利用JFH-1作为骨架，建立了一些含有来自同一或不同基因型的HCV结构蛋白(Core，E1，E2)、p7和NS2的重组病毒，这些重组病毒在放入适应性突变后能够产生高滴度的病 毒，为对不同基因型的病毒进行疫苗开发和抑制剂研究打下了基础。然而，这些研究几乎全部是基于实验室的已优化过的原型株。虽然这些原型病毒株的建立大大推进了新的体外研究系统以及抗病毒治疗策略的发展，但是它们未必能够真实地反映来自HCV感染病人的异质病毒种群(准种)。 目前，直接来自于临床病毒株的全长或者嵌合的HCV细胞培养模型还没有报道。 
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株及其制备方法。 在本专利技术的第一方面，提供一种氨基酸序列，其包括来自丙型肝炎病毒1b基因型的结构蛋白Core、E1、E2、p7和非结构蛋白NS2的第一个跨膜区，所述氨基酸序列具有与SEQ ID NO:1-4中任何一条具有90%以上同源性的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列具有选自以下至少一项条件或其任意组合：从N末端的氨基酸残基起算，第38位氨基酸为S；第180位氨基酸为T；第183位氨基酸为P；第184位氨基酸为R；第217位氨基酸为T；第253位氨基酸为F；第290位氨基酸为P；第364位氨基酸为T；第365位氨基酸为A；第397位氨基酸为R、第398位氨基酸为D；第405位氨基酸为L；第415位氨基酸为S；第416位氨基酸为A；第476位氨基酸为T；第531位氨基酸为G；第532位氨基酸为S；第785位氨基酸为E；第827位氨基酸为V；第835位氨基酸为C；第837位氨基酸为L。 在一个优选例中，所述的氨基酸序列，存在选自以下的至少一项条件： (i)从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列的第364位氨基酸为T、第476位氨基酸为T、第531位氨基酸为G(对应26C3)；或 (ii)从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列的第290位氨基酸为P、第476位氨基酸为T、第531位氨基酸为G(对应26C6)；或 (iii)从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列的第180位氨基酸为T、第837位氨基酸为L(对应52B6)；或 (iv)从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列的第38位氨基酸为S、第183位氨基酸为P、第184位氨基酸为R、第217位氨基酸为T、第365位氨基酸为A；第405位氨基酸为L、第415位氨基酸为S、第532位氨基酸为S、第785位氨基酸为E，第827位氨基酸为V(对应79L9) 在另一优选例中，(i)中，还包括：从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列的第253位氨基酸为F(对应26C3mt)；或 (ii)中，还包括：从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列的第835位氨基酸为C(对应26C6mt)；或 (iii)中，还包括：从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列的第397位氨基酸为R、第398位氨基酸为D、第416位氨基酸为A(对应52B6mt)。 在另一优选例中，所述的氨基酸序列具有SEQ ID NO:5-11(分别对应于26C3，26C6，52B6，79L9，26C3mt，26C6mt，52B6mt的Core-NS21stTMD段氨基酸序列)中任一氨基酸序列。 在本专利技术的另一方面，提供编码前面任一项所述的氨基酸序列的多核苷酸，所述的多核苷酸为DNA或RNA。 在本专利技术的另一方面，提供所述的蛋白或编码其的多核苷酸的用途，用于制备重组丙型肝炎病毒株，尤其是感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株。 在本专利技术的另一方面，提供一种用于制备重组丙型肝炎病毒株的重组病毒质粒，该重组病毒质粒包含所述的多核苷酸。 在一个优选例中，所述的重组病毒质粒还包括来丙型肝炎病毒基因组的5’非翻译区、NS2第一跨膜区以外片段编码基因、NS3编码基因、NS4A编码基因、NS4B编码基因、NS5A编码基因、NS5B编码基因和3’非翻译区。较佳地，所述的丙型肝炎病毒为与前面所述的丙型肝炎病毒蛋白或核酸来源不同的另一株丙型肝炎病毒；较佳地，所述的另一株丙型肝炎病毒是JFH-1株。 在本专利技术的另一方面，提供一种制备具有体外复制感染能力的重组嵌合型丙型肝炎病毒的方法，所述方法包括：(a)提供所述的重组病毒质粒；(b)将步骤(a)的重组病毒质粒在体外转录合成RNA后，转染病毒包装细胞，培养经转染的病毒包装细胞，获得重组嵌合型丙型肝炎病毒株。 在一个优选例中，所述的病毒包装细胞是人肝癌细胞系；较佳地，所述的病毒包装细胞包括但不限于：Huh7.5.1细胞、Huh7细胞，HepG2、IMY-N9；较佳地所述的病毒包装细胞为Huh7.5.1细胞。 在本专利技术的另一方面，提供分离的突变型的丙型肝炎病毒E1蛋白，该蛋白的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:1-4任何一条中第192-383位所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列，但其中具有选自以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种氨基酸序列，其包括来自丙型肝炎病毒1b基因型的结构蛋白Core、E1、E2、p7和非结构蛋白NS2的第一个跨膜区，其特征在于，所述氨基酸序列具有与SEQ ID NO:1‑4中任何一条具有90%以上同源性的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列具有选自以下至少一项条件或其任意组合：从N末端的氨基酸残基起算，第38位氨基酸为S；第180位氨基酸为T；第183位氨基酸为P；第184位氨基酸为R；第217位氨基酸为T；第253位氨基酸为F；第290位氨基酸为P；第364位氨基酸为T；第365位氨基酸为A；第397位氨基酸为R、第398位氨基酸为D；第405位氨基酸为L；第415位氨基酸为S；第416位氨基酸为A；第476位氨基酸为T；第531位氨基酸为G；第532位氨基酸为S；第785位氨基酸为E；第827位氨基酸为V；第835位氨基酸为C；第837位氨基酸为L。

【技术特征摘要】
1.一种氨基酸序列，其包括来自丙型肝炎病毒1b基因型的结构蛋白Core、
E1、E2、p7和非结构蛋白NS2的第一个跨膜区，其特征在于，所述氨基酸序列具
有与SEQ ID NO:1-4中任何一条具有90%以上同源性的氨基酸序列，并且所述氨
基酸序列具有选自以下至少一项条件或其任意组合：
从N末端的氨基酸残基起算，第38位氨基酸为S；第180位氨基酸为T；第
183位氨基酸为P；第184位氨基酸为R；第217位氨基酸为T；第253位氨基酸
为F；第290位氨基酸为P；第364位氨基酸为T；第365位氨基酸为A；第397
位氨基酸为R、第398位氨基酸为D；第405位氨基酸为L；第415位氨基酸为S；
第416位氨基酸为A；第476位氨基酸为T；第531位氨基酸为G；第532位氨基
酸为S；第785位氨基酸为E；第827位氨基酸为V；第835位氨基酸为C；第837
位氨基酸为L。
2.如权利要求1所述的氨基酸序列，存在选自以下的至少一项条件：
(i)从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列的第364位氨
基酸为T、第476位氨基酸为T、第531位氨基酸为G；或
(ii)从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列的第290位
氨基酸为P、第476位氨基酸为T、第531位氨基酸为G；或
(iii)从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列的第180位
氨基酸为T、第837位氨基酸为L；或
(iv)从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列的第38位氨
基酸为S、第183位氨基酸为P、第184位氨基酸为R、第217位氨基酸为T、
第365位氨基酸为A；第405位氨基酸为L、第415位氨基酸为S、第532位
氨基酸为S、第785位氨基酸为E，第827位氨基酸为V。
3.如权利要求2所述的氨基酸序列，其特征在于，(i)中，还包括：从N末端
的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列的第253位氨基酸为F；或
(ii)中，还包括：从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列
的第835位氨基酸为C；或
(iii)中，还包括：从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO:1序列

\t的第397位氨基酸为R、第398位氨基酸为D、第416位氨基酸为A。
4.如权利要求1-3所述的氨基酸序列，其特征在于，具有SEQ ID NO:5-11中
任一氨基酸序列。
5.编码如权利要求1-4任一项所述的氨基酸序列的多核苷酸，所述的多核苷
酸为DNA或RNA。
6.权利要求1-5任一所述的蛋白或编码其的多核苷酸的用途，用于制备重组
丙型肝炎病毒株，尤其是感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株。
7.一种用于制备重组丙型肝炎病毒株的重组病毒质粒，该重组病毒质粒包含
权利要求5所述的多核苷酸。
8.如权利要求7所述的重组病毒质粒，其特征在于，还包括丙型肝炎病毒基
因组的5’非翻译区、NS2第一跨膜区以外片段编码基因、NS3编码基因、NS4A编
码基因、NS4B编码基因、NS5A编码基因、NS5B编码基因和3’非翻译区。
9.如权利要求8所述的重组病毒质粒，其特征在于，所述的丙型肝炎病毒基
因组来自与权利要求1-5所述的丙型肝炎病毒蛋白或核酸来源不同的另一株丙型
肝炎病毒；较佳地，所述的另一株丙型肝炎病毒是JFH-1株。
10.一种制备具有体外复制感染能力的重组嵌合型丙型肝炎病毒的方法，其特
征在于，所述方法包括：
(a)提供如权利要求7-9任一项所述的重组病毒质粒；
(b)将步骤(a)的重组病毒质...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟劲，卢捷，陶万银，李瑞，向禹，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31