【技术实现步骤摘要】
一种冠状病毒SARS-CoV-2数字PCR多重检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种病毒检测试剂盒及其应用,尤其涉及一种冠状病毒SARS-CoV-2数字PCR多重检测试剂盒及其应用,属于临床检验
技术介绍
新型冠状病毒即“SARS-CoV-2”是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中,感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭,甚至死亡。核酸检测作为目前新型冠状病毒检测方法的金标准,在快速诊断、疗效评估以及疫情防控过程中发挥着至关重要的作用。但是,已有的各厂家快速研发的SARS-CoV-2实时荧光RT-PCR试剂盒并不稳定,特别是个别病例和康复患者在不同时间经5次以上的检测后结果出现由阴性转为阳性,为临床诊断和疾病控制带来极大的困难。因此实时荧光RT-PCR对有限的标本材料以及早期低病毒含量样本的检测仍存在一定的应用限制,如检测过程依赖于扩增曲线的阈值(CT)进行定量,受扩增效率的影响。此外,在新冠病毒依然肆虐全球的局势下,病毒株的变异愈发加大了疫情防控的难度。有报道英国新型冠状病毒变异株B.1.1.7,其传播速度比之前的毒株高出70%,且致死率比原病毒提高30%;南非发现的一种新冠病毒毒株B.1.351被认为比原病毒传染性高出至少50%,更可怕的是其刺突蛋白上出现的关键突变使其对疫苗或自然免疫产生抵抗。2021年1月以来,我国上海、广东、山东等地疾控中心也陆续报告,发现英国报道的新冠病毒B.1.1.7突变株以及南非 ...
【技术保护点】
1.一种冠状病毒SARS-CoV-2数字PCR多重检测试剂盒,该试剂盒包括数字PCR反应液、数字PCR引物混合液和阴性对照溶液,并结合全自动微滴芯片数字PCR系统完成对冠状病毒SARS-CoV-2的检测;其中所述数字PCR引物混合液是用于检测冠状病毒SARS-CoV-2非突变株ORF1ab基因、N基因、E基因、突变毒株B.1.1.7S基因中N501Y、HV69-70del位点及南非突变毒株B.1.351S基因中E484K、K417N位点的正向引物、反向引物和引物探针的混合液,所述引物探针上设有至少一个荧光基团;/n其特征在于:/n所述数字PCR反应液的组分是250mM的PCR缓冲液,其为pH8.0、Tris-Hcl缓冲液,20mM的Mg
【技术特征摘要】
1.一种冠状病毒SARS-CoV-2数字PCR多重检测试剂盒,该试剂盒包括数字PCR反应液、数字PCR引物混合液和阴性对照溶液,并结合全自动微滴芯片数字PCR系统完成对冠状病毒SARS-CoV-2的检测;其中所述数字PCR引物混合液是用于检测冠状病毒SARS-CoV-2非突变株ORF1ab基因、N基因、E基因、突变毒株B.1.1.7S基因中N501Y、HV69-70del位点及南非突变毒株B.1.351S基因中E484K、K417N位点的正向引物、反向引物和引物探针的混合液,所述引物探针上设有至少一个荧光基团;
其特征在于:
所述数字PCR反应液的组分是250mM的PCR缓冲液,其为pH8.0、Tris-Hcl缓冲液,20mM的Mg2+溶液,4种dNTPs各1mM,5U的c-MMLV酶,10U的热启动Taq酶,40U的RNasin;
所述检测冠状病毒SARS-CoV-2非突变株ORF1ab基因用的正向引物、反向引物和引物探针分别为ORF1ab-F、ORF1ab-R和ORF1ab-P;其中所述正向引物ORF1ab-F的核苷酸序列为5’-GAGATGCCACAACTGCTT-3’,所述反向引物ORF1ab-R的核苷酸序列为5’-GCTATTCATACAGGCGTT-3’,所述引物探针ORF1ab-P的核苷酸序列为5’-CY5-AGTGTTTTTAACATTTGTCA-BHQ3-3’,其中,CY5为荧光基团,BHQ3为淬灭基团;
所述检测冠状病毒SARS-CoV-2非突变株N基因用的正向引物、反向引物和引物探针分别为N-F、N-R、N-P;其中所述正向引物N-F的核苷酸序列为5’-TGGACTTCCCTATGGTGC-3’,所述反向引物N-R的核苷酸序列为5’-AGCACGATGTTGAAGGAGT-3’,所述引物探针N-P的核苷酸序列为5’-CY5.5-CGGCATCATATGGGTTGCAA-BHQ3-3’,其中,CY5.5为荧光基团,BHQ3为淬灭基团;
所述检测冠状病毒SARS-CoV-2非突变株E基因的正向引物、反向引物和引物探针分别为E-F、E-R、E-P;其中所述正向引物E-F的核苷酸序列为5’-ATGTACTCATTCGTTTCG-3’,所述反向引物E-R的核苷酸序列为5’-CAATCGAAGCGCAGTAAG-3’,所述引物探针E-P的核苷酸序列为5’-VIC-ATAGTTAATAGCGTACTTCT-BHQ1-3’,其中VIC为荧光基团,BHQ1为淬灭基团;
所述检测冠状病毒SARS-CoV-2突变毒株B.1.1.7S基因中N501Y位点的正向引物、反向引物和引物探针分别为N501Y-F、N501Y-R、N501Y-P;其中所述正向引物N501Y-F的核苷酸序列为5’-CAATTTTGTAATGATCCA-3’,所述反向引物N501Y-R的核苷酸序列为5’-TGCAATTATTCGCACTAG-3’,所述引物探针N501Y-P的核苷酸序列为5’-ROX-TGTTTACCACAAAAACAACA-MGB-3’,其中ROX为荧光基团,MGB为淬灭基团;
所述检测冠状病毒SARS-CoV-2突变毒株B.1.1.7S基因中HV69-70del位点的正向引物、反向引物和引物探针分别为HV69-70del-F、HV69-70del-R、HV69-70del-P;其中所述正向引物HV69-70del-F的核苷酸序列为5’-CTTTTCCAATGTTACTT-3’,所述反向引物HV69-70del-R的核苷酸序列为5’-AATAAACACCATCATTAA-3’,所述引物探针HV69-70del-P的核苷酸序列为5’-CY7-TGCTATCTCTGGGACCAATGG-MGB-3’,其中CY7为荧光基团,MGB为淬灭基团;
所述检测冠状病毒SARS-CoV-2南非突变毒株B.1.351S基因中E484K位点的正向引物、反向引物和引物探针分别为E484K-F、E484K-R、E484K-P;其中所述正向引物E484K-F的核苷酸序列为5’-TCTATCAGGCCGGTAGC-3’,所述反向引物E484K-R的核苷酸序列为5’-CCATTAGTGGGTTGGAAA-3’,所述引物探针E484K-P的核苷酸序列为5’-FAM-AATGGTGTTAAAGGTTTTAA-MGB-3’,其中FAM为荧光基团,MGB为淬灭基团;
所述检测冠状病毒SARS-CoV-2南非突变毒株B.1.351S基因中K417N位点的正向引物、反向引物和引物探针分别为K417N-F、K417N-R、K417N-P;其中所述正向引物K417N-F的核苷酸序列为5’-GATGAAGTCAGACAAATC-3’,所述反向引物K417N-R的核苷酸序列为5’-TTCCAAGCTATAACGCAG-3’,所述引物探针K417N-P的核苷酸序列为5’-Atto425-CTGGAAATATTGCTGATTAT-MGB-3’,其中Atto425为荧光基团,MGB为淬灭基团;
所述正向引物或反向引物的浓度为500-1000nM,所述引物探针的浓度为150-250nM;
所述阴性对照溶液是经焦炭酸二乙酯处理过的无核酶水;
所述冠状病毒SARS-CoV-2数字PCR多重检测试剂盒PCR反应体系总体积为15μL,其中数字PCR反应液的加入量为3μL、数字PCR引物混合液的加入量为2μL、核酸样本的加入量为3μL、无核酶...
【专利技术属性】
技术研发人员:李登旺,陈振,欧兰香,蔡克海,张绍明,吴冰,朱成龙,丁兴龙,李文靖,
申请(专利权)人:山东莱博生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:山东;37
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