一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒，由设在盒体内的偶联有重组人ACE2受体蛋白(ACE2‑hFc)的磁微球、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、RBD蛋白(HRP‑RBD)酶结合物、20×浓缩洗涤液、发光液构成。本发明专利技术还公开了所述试剂盒在检测含新型冠状病毒中和抗体生物样品中的应用。实验证实本发明专利技术的试剂盒稳定性高、选择性强，检测速度快、费用低廉、易于操作，克服了现有技术中检测中和抗体时，实验室环境要求高、操作时长等缺点，将操作时间由120分钟缩短至20分钟。具有极大的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中和抗体的检测，尤其涉及一种一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用，属于临床检验

技术介绍
由新冠病毒(SARS-CoV-2)引起的新冠肺炎(COVID-19)大流行是一个世纪以来人类面临的最严峻挑战。新型冠状病毒即“SARS-CoV-2”感染后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。研究表明，冠状病毒S蛋白是病毒毒力的关键因子，是决定病毒毒力、组织嗜性和宿主范围的关键部分，也是中和抗体和疫苗设计的主要靶标。而评价疫苗接种后的效果，最直接的检测方法为新冠中和抗体的检测。因为，能识别新冠病毒的S(刺突)蛋白上的RBD区(受体结合域)的中和抗体，就可以阻断新冠病毒和人细胞上的ACE2受体结合，使得新冠病毒无法感染人细胞。此外，中和抗体可以与其他免疫成分——例如补体、吞噬细胞和自然杀伤细胞等——相互作用。这些效应反应都可以帮助清除病毒和被感染的细胞。中和抗体浓度越高，一般保护作用越好。因此，早期预测疫苗好坏的指标之一，就是看它能诱发人体内产生多少中和抗体。传统的检测中和抗体的方法为活病毒或假病毒中和试验。试验方法需要专业细胞培养过程，对实验等级要求高，周期长、操作复杂，不适合普通接种疫苗人群高通量筛查。中和抗体滴度可以反映出血液样品中抗体水平的指标，即接种疫苗后人体内免疫应答的好坏或强弱。随着新型冠状病毒疫苗的上市，对接种新冠疫苗人群和新冠感染后康复人群的中和抗体评价需要快速、可靠的、稳定、安全的评价方法。目前已有关于新型冠状病毒中和抗体酶联免疫的竞争抑制检测方法(CN202010919164.X、CN202010952237.5)，但上述专利中公布的实验检测方法均属酶联免疫法，在实验操作中存在操作时间长(2-3小时)，手工操作等缺点。因新冠病毒传染力很强，增加人工操作和反应时间，也相应增加了操作人员被感染的可能性。此外，因竞争抑制法中，因加样时间和加样间隔的影响，易对最终检测结果造成假阳结果，会影响最终对中和抗体含量的判断。磁微粒化学发光技术是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种新兴分析方法。该技术充分利用了磁性分离技术的快速易自动化性，化学发光技术的高灵敏度性，以及免疫分析的特异性，是目前最受欢迎的标记免疫分析技术。现有技术中，经检索以辣根过氧化物酶标记RBD蛋白(HRP-RBD)和重组人ACE2受体蛋白(ACE2-hFc)之间的相互作用可以被SARS-CoV-2RBD中和抗体阻断为原理，制备有关基于磁微粒化学发光法的一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用还未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用。本专利技术所述的一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒，由设在盒体内的偶联有重组人ACE2受体蛋白(ACE2-hFc)的磁微球、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、RBD蛋白(HRP-RBD)酶结合物、20×浓缩洗涤液、发光液构成；其特征在于：所述磁微球偶联有浓度为5-100μg/mg的重组人ACE2受体蛋白(ACE2-hFc)；该磁性微球的工作浓度为0.2-0.5mg/mL，稀释液为保存液；所述RBD中和抗体标准品溶液为：样品稀释液稀释的浓度为1000ng/ml的RBD中和抗体溶液；所述阴性对照为正常人新冠病毒SARS-CoV-2抗体阴性血清；所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl8g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、SDS1g、酪蛋白钠盐5g、TritonX-1000.1mL、Proclin3001mL，pH为7.4；所述RBD酶结合物是辣根过氧化物酶标记的重组RBD蛋白(HRP-RBD)；HRP标记RBD使用量为其与包被抗原结合恰好饱和的量，该RBD酶结合物使用的效价浓度为1:10000，稀释液为酶结合物稀释液；所述RBD酶结合物的制备方法为：利用过碘酸钠法标记的RBD蛋白与辣根过氧化物酶的结合物。制备方法不限于此方法，其余蛋白标记方法亦可。所述20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl8.0g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、吐温200.5mL；所述发光液包括A液和B液，浓度为3.0mmol/L的鲁米诺溶液与0.3mmol/L对碘苯酚溶液等体积比的混合液命名为A液；浓度为7.5mmol/L的双氧水命名为B液；使用时将A液与B液按体积比1﹕1混合。上述一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒中，所述磁微球的制备方法是：1.1)配制偶联缓冲液：即配制0.01mol/L的MES缓冲溶液，并调整pH值为6.0；MES1.95g纯化水定容至1000mL过滤除菌，4℃保存；1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：过滤除菌，4℃保存；1.3)配制保存液，保存液的配方及制法是：过滤除菌，4℃保存；1.4)偶联操作(1)羧基磁性微球的活化：取10mg羧基磁性微球，加入500μL的EDC/NHS溶液室温下活化30min，磁分离，偶联缓冲液洗涤磁性微球，得活化后的磁性微球；其中，所述EDC是：1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐，所述NHS是：N-羟基丁二酰亚胺，其溶液使用偶联缓冲液为溶剂配制，其浓度均为2mg/mL，使用前将EDC与NHS溶液等体积比混匀即得到EDC/NHS溶液；(2)羧基磁性微球与ACE2-hFc偶联：向上述活化后的磁性微球中加入浓度为1-10mg/mL的ACE2-hFc，使磁微球偶联ACE2-hFc的浓度为5-100μg/mg，室温反应3h，磁分离，洗涤液洗涤，即得免疫磁性微球，加保存液于4℃保存，备用；使用时用保存液稀释使磁性微球的工作浓度为0.2-0.5mg/mL。上述一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒中：所述重组人ACE2受体蛋白(ACE2-hFc)是利用CHO细胞表达的人ACE2蛋白与人源化Fc融合的重组蛋白；所述RBD蛋白是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长RBD的重组蛋白；所述的RBD中和抗体是用来自于测定的新冠康复患者中和抗体可变区序列并与人源化Fc融合，通过CHO细胞重组表达形成的。上述一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒中：所述磁微球偶联有浓度优选60-100μg/mg的重组人ACE2受体蛋白(ACE2-hFc)；该磁性微球的工作浓度优选为0.3-0.5mg/mL，稀释液为保存液。上述一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒，由设在盒体内的偶联有重组人ACE2受体蛋白(ACE2-hFc)的磁微球、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、RBD蛋白(HRP-RBD)酶结合物、20×浓缩洗涤液、发光液构成；/n其特征在于：/n所述磁微球偶联有浓度为5-100μg/mg的重组人ACE2受体蛋白(ACE2-hFc)；该磁性微球的工作浓度为0.2-0.5mg/mL，稀释液为保存液；/n所述RBD中和抗体标准品溶液为：样品稀释液稀释的浓度为1000ng/ml的RBD中和抗体溶液；/n所述阴性对照为正常人新冠病毒SARS-CoV-2抗体阴性血清；/n所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH

【技术特征摘要】
1.一种一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒，由设在盒体内的偶联有重组人ACE2受体蛋白(ACE2-hFc)的磁微球、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、RBD蛋白(HRP-RBD)酶结合物、20×浓缩洗涤液、发光液构成；
其特征在于：
所述磁微球偶联有浓度为5-100μg/mg的重组人ACE2受体蛋白(ACE2-hFc)；该磁性微球的工作浓度为0.2-0.5mg/mL，稀释液为保存液；
所述RBD中和抗体标准品溶液为：样品稀释液稀释的浓度为1000ng/ml的RBD中和抗体溶液；
所述阴性对照为正常人新冠病毒SARS-CoV-2抗体阴性血清；
所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl8g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、SDS1g、酪蛋白钠盐5g、TritonX-1000.1mL、Proclin3001mL，pH为7.4；
所述RBD酶结合物是辣根过氧化物酶标记的重组RBD蛋白(HRP-RBD)；HRP标记RBD使用量为其与包被抗原结合恰好饱和的量，该RBD酶结合物使用的效价浓度为1:10000，稀释液为酶结合物稀释液；
所述20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl8.0g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、吐温200.5mL；
所述发光液包括A液和B液，浓度为3.0mmol/L的鲁米诺溶液与0.3mmol/L对碘苯酚溶液等体积比的混合液命名为A液；浓度为7.5mmol/L的双氧水命名为B液；使用时将A液与B液按体积比1﹕1混合。


2.根据权利要求1所述一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒，其特征在于，所述磁微球的制备方法是：
1.1)配制偶联缓冲液：即配制0.01mol/L的MES缓冲溶液，并调整pH值为6.0；
MES1.95g
纯化水定容至1000mL
过滤除菌，4℃保存；
1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：






过滤除菌，4℃保存；
1.3)配制保存液，保存液的配方及制法是：



过滤除菌，4℃保存；
1.4)偶联操作
(1)羧基磁性微球的活化：取10mg羧基磁性微球，加入500μL的EDC/NHS溶液室温下活化30min，磁分离，偶联缓冲液洗涤磁性微球，得活化后的磁性微球；
其中，所述EDC是：1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐，所述NHS是：N-羟基丁二酰亚胺，其溶液使用偶联缓冲液为溶剂配制，其浓度均为2mg/mL，使用前将EDC与NHS溶液等体积比混匀即得到EDC/NHS溶液；
(2)羧基磁性微球与ACE2-hF...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈振，欧兰香，武建伟，王岩，蔡克海，寇宗阳，
申请(专利权)人：山东莱博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37