一种冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的检测试剂盒与其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种冠状病毒SARS‑CoV‑2及其突变毒株的检测试剂盒，包括数字PCR反应液、数字PCR引物混合液和阴性对照溶液，并结合全自动微滴芯片数字PCR系统完成对冠状病毒SARS‑CoV‑2及其突变毒株的检测。本发明专利技术是针对冠状病毒SARS‑CoV‑2非突变株ORF1ab基因、N基因2个靶基因和其突变毒株S基因中E484K、L452R、D614G位点共3个突变位点设计特异性引物探针，通过多基因不同位点数字PCR检测提高试剂盒检测准确性，并实现快速判定。本发明专利技术试剂盒在新型冠状病毒检测、筛查及疫苗开发时更符合临床需求，也使检测更快捷和应用更广泛。

【技术实现步骤摘要】
一种冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的检测试剂盒与其应用
本专利技术涉及一种病毒检测试剂盒及其应用，尤其涉及一种冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的数字PCR检测试剂盒与其应用，属于临床检验

技术介绍
新型冠状病毒即“SARS-CoV-2”是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。密切跟踪新冠病毒突变株是现在世界各地科学家研究的重点，对这些突变的研究有利于分析病毒传播性和免疫抗性。新冠疫情已经持续一年，从当前是数据来看，新冠病毒变异速度并不快，大约是流感病毒的一半，HIV病毒的四分之一，在新冠病毒约3万个碱基的RNA基因组中每月大约会有两个碱基的突变。但是近期出现的3种迅速传播的突变株备受关注。这3株突变体分别在英国、南非和巴西发现，除了具有较多的突变位点，还共同具有相同的基因位点突变E484K。在E484K突变中，带负电荷的氨基酸(谷氨酸)被带正电荷的氨基酸(赖氨酸)取代，结构分析表明，由于E484K突变，产生了一个新的ACE2结合位点。这可能使得ACE2和位于RBD的天然结合位点之间产生了明显更强的相互作用。E484K突变会使得新冠病毒的传染性更强，同时多篇研究都指出E484K还会导致新冠病毒免疫逃逸能力。目前多个研究都表明，E484K突变可能是导致疫苗防护效力下降的关键。而在印度，发现了一种同时带有E484Q和L452R两种突变的新冠病毒。斯坦福大学临床病毒学实验室主任平斯基(BenjaminPinsky)表示，两个关键突变分别曾在其他变体中出现，但此前从未在单个菌株中共同被发现。L452R突变将促使病毒更易传播，降低疫苗的有效性。同时，有实验室研究发现新冠病毒D614G变异可能导致病毒加速复制和加强其传播性，世卫组织官员表示：研究显示29％的新冠病毒样本都出现了该变异，带有该变异的病毒已在欧洲及美洲传播。数字PCR(DigitalPCR-dPCR)技术是第三代PCR技术，是一种核酸定量分析技术，操作简单，质量可控且敏感度高，是PCR领域的前沿技术及发展方向。数字PCR利用泊松分布计算出目标拷贝数，实现单分子检测，与qRT-PCR相比，检测过程不依赖于扩增曲线的阈值(CT)进行定量，不受扩增效率的影响，且操作简便灵敏度高。其在肿瘤液态活检、伴随诊断、遗传疾病诊断、无创产前检查、微生物、传染病、食品安全检测等领域具有广阔应用前景。基于以上数据和结果，表明新型冠状病毒在不断的突变中，逃逸性越来越强。加速针对这些易突变位点开发出相应的针对于突变株的数字PCR检测试剂盒将有利于我国面对世界复杂疫情的防控，建立有效的屏障。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的数字PCR检测试剂盒与其应用。本专利技术所述的冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的检测试剂盒，该试剂盒为数字PCR多重突变检测试剂盒，其包括数字PCR反应液、数字PCR引物混合液和阴性对照溶液，并结合全自动微滴芯片数字PCR系统完成对冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的检测；其中所述数字PCR引物混合液是用于检测冠状病毒SARS-CoV-2非突变株ORF1ab基因、N基因、突变毒株S基因中E484K、L452R、D614G位点的正向引物、反向引物和引物探针的混合液，所述引物探针上设有至少一个荧光基团；其特征在于：所述数字PCR反应液的组分是250mM的PCR缓冲液，其为pH8.0、Tris-Hcl缓冲液，20mM的Mg2+溶液，4种dNTPs各1mM，5U的c-MMLV酶，10U的热启动Taq酶，40U的RNasin；所述检测冠状病毒SARS-CoV-2非突变株ORF1ab基因用的正向引物、反向引物和引物探针分别为ORF1ab-F、ORF1ab-R和ORF1ab-P；其中所述正向引物ORF1ab-F的核苷酸序列为5’-GAGATGCCACAACTGCTT-3’，所述反向引物ORF1ab-R的核苷酸序列为5’-GCTATTCATACAGGCGTT-3’，所述引物探针ORF1ab-P的核苷酸序列为5’-VIC-AGTGTTTTTAACATTTGTCA-BHQ1-3’，其中，VIC为荧光基团，BHQ1为淬灭基团；所述检测冠状病毒SARS-CoV-2非突变株N基因用的正向引物、反向引物和引物探针分别为N-F、N-R、N-P；其中所述正向引物N-F的核苷酸序列为5’-TGGACTTCCCTATGGTGC-3’，所述反向引物N-R的核苷酸序列为5’-AGCACGATGTTGAAGGAGT-3’，所述引物探针N-P的核苷酸序列为5’-CY5-CGGCATCATATGGGTTGCAA-BHQ3-3’，其中，CY5为荧光基团，BHQ3为淬灭基团；所述检测冠状病毒SARS-CoV-2突变毒株S基因中E484K位点的正向引物、反向引物和引物探针分别为E484K-F、E484K-R、E484K-P；其中所述正向引物E484K-F的核苷酸序列为5’-TCTATCAGGCCGGTAGC-3’，所述反向引物E484K-R的核苷酸序列为5’-CCATTAGTGGGTTGGAAA-3’，所述引物探针E484K-P的核苷酸序列为5’-FAM-AATGGTGTTAAAGGTTTTAA-MGB-3’，其中FAM为荧光基团，MGB为淬灭基团；所述检测冠状病毒SARS-CoV-2突变毒株S基因中L452R位点的正向引物、反向引物和引物探针分别为L452R-F、L452R-R、L452R-P；其中所述正向引物L452R-F的核苷酸序列为5’-CTTGATTCTAAGGTTGGT-3’，所述反向引物L452R-R的核苷酸序列为5’-ACACCATTACAAGGTGTG-3’，所述引物探针L452R-P的核苷酸序列为5’-ROX-TAATTACCGGTATAGATTGT-MGB-3’，其中ROX为荧光基团，MGB为淬灭基团；所述检测冠状病毒SARS-CoV-2突变毒株S基因中D614G位点的正向引物、反向引物和引物探针分别为D614G-F、D614G-R、D614G-P；其中所述正向引物D614G-F的核苷酸序列为5’-ATAACACCAGGAACAAATAC-3’，所述反向引物D614G-R的核苷酸序列为5’-ACGCCAAGTAGGAGTAAG-3’，所述引物探针D614G-P的核苷酸序列为5’-Atto425-ATCAGGGTGTTAACTGCACAGAA-MGB-3’，其中Atto425为荧光基团，MGB为淬灭基团；所述正向引物或反向引物的浓度为500-1000nM，所述引物探针的浓度为150-250nM；所述阴性对照溶液是经焦炭酸二乙酯处理过的无核酶水；所述冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的检测试剂盒PCR反应体系总体积为15μL，其中数字PCR反应液的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的检测试剂盒，该试剂盒为数字PCR多重突变检测试剂盒，其包括数字PCR反应液、数字PCR引物混合液和阴性对照溶液，并结合全自动微滴芯片数字PCR系统完成对冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的检测；其中所述数字PCR引物混合液是用于检测冠状病毒SARS-CoV-2非突变株ORF1ab基因、N基因、突变毒株S基因中E484K、L452R、D614G位点的正向引物、反向引物和引物探针的混合液，所述引物探针上设有至少一个荧光基团；/n其特征在于：/n所述数字PCR反应液的组分是250mM的PCR缓冲液，其为pH8.0、Tris-Hcl缓冲液，20mM的Mg

【技术特征摘要】
1.一种冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的检测试剂盒，该试剂盒为数字PCR多重突变检测试剂盒，其包括数字PCR反应液、数字PCR引物混合液和阴性对照溶液，并结合全自动微滴芯片数字PCR系统完成对冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的检测；其中所述数字PCR引物混合液是用于检测冠状病毒SARS-CoV-2非突变株ORF1ab基因、N基因、突变毒株S基因中E484K、L452R、D614G位点的正向引物、反向引物和引物探针的混合液，所述引物探针上设有至少一个荧光基团；
其特征在于：
所述数字PCR反应液的组分是250mM的PCR缓冲液，其为pH8.0、Tris-Hcl缓冲液，20mM的Mg2+溶液，4种dNTPs各1mM，5U的c-MMLV酶，10U的热启动Taq酶，40U的RNasin；
所述检测冠状病毒SARS-CoV-2非突变株ORF1ab基因用的正向引物、反向引物和引物探针分别为ORF1ab-F、ORF1ab-R和ORF1ab-P；其中所述正向引物ORF1ab-F的核苷酸序列为5’-GAGATGCCACAACTGCTT-3’，所述反向引物ORF1ab-R的核苷酸序列为5’-GCTATTCATACAGGCGTT-3’，所述引物探针ORF1ab-P的核苷酸序列为5’-VIC-AGTGTTTTTAACATTTGTCA-BHQ1-3’，其中，VIC为荧光基团，BHQ1为淬灭基团；
所述检测冠状病毒SARS-CoV-2非突变株N基因用的正向引物、反向引物和引物探针分别为N-F、N-R、N-P；其中所述正向引物N-F的核苷酸序列为5’-TGGACTTCCCTATGGTGC-3’，所述反向引物N-R的核苷酸序列为5’-AGCACGATGTTGAAGGAGT-3’，所述引物探针N-P的核苷酸序列为5’-CY5-CGGCATCATATGGGTTGCAA-BHQ3-3’，其中，CY5为荧光基团，BHQ3为淬灭基团；
所述检测冠状病毒SARS-CoV-2突变毒株S基因中E484K位点的正向引物、反向引物和引物探针分别为E484K-F、E484K-R、E484K-P；其中所述正向引物E484K-F的核苷酸序列为5’-TCTATCAGGCCGGTAGC-3’，所述反向引物E484K-R的核苷酸序列为5’-CCATTAGTGGGTTGGAAA-3’，所述引物探针E484K-P的核苷酸序列为5’-FAM-AATGGTGTTAAAGGTTTTAA-MGB-3’，其中其中FAM为荧光基团，MGB为淬灭基团；
所述检测冠状病毒SARS-CoV-2突变毒株S基因中L452R位点的正向引物、反向引物和引物探针分别为L452R-F、L452R-R、L452R-P；其中所述正向引物L452R-F的核苷酸序列为5’-CTTGATTCTAAGGTTGGT-3’，所述反向引物L452R-R的核苷酸序列为5’-ACACCATTACAAGGTGTG-3’，所述引物探针L452R-P的核苷酸序列为5’-ROX-TAATTACCGGTATAGATTGT-MGB-3’，其中ROX为荧光基团，MGB为淬灭基团；
所述检测冠状病毒SARS-CoV-2突变毒株S基因中D614G位点的正向引物、反向引物和引物探针分别为D614G-F、D614G-R、D614G-P；其中所述正向引物D614G-F的核苷酸序列为5’-ATAACACCAGGAACAAATAC-3’，所述反向引物D614G-R的核苷酸序列为5’-ACGCCAAGTAGGAGTAAG-3’，所述引物探针D614G-P的核苷酸序列为5’-Atto425-ATCAGGGTGTTAACTGCACAGAA-MGB-3’，其中Atto425为荧光基团，MGB为淬灭基团；
所述正向引物或反向引物的浓度为500-1000nM，所述引物探针的浓度为150-250nM；
所述阴性对照溶液是经焦炭酸二乙酯处理过的无核酶水；
所述冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的检测试剂盒PCR反应体系总体积为15μL，其中数字PCR反应液的加入量为3μL、数字PCR引物混合液的加入量为2μL、核酸样本的加入量为3μL、无核酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈振，欧兰香，朱成龙，寇宗阳，王岩，贾秀玲，苏真真，高丽鹤，
申请(专利权)人：山东莱博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37