一种基于PCR和nanopore测序检测脑脊液感染哪些病原体的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于PCR和nanopore测序检测脑脊液感染哪些病原体的方法。实验证明，采用本发明专利技术提供的方法检测脑脊液，可以准确判断中枢神经系统感染的病原体为Enterovirus、Lymphocytic choriomeningitis virus、Neisseria meningitidis、Cytomegalovirus、Mycobacrterium tuberculosis、Nocardia Farcinica、Herpes simplexvirus 1、Human herpesvirus 6、Listeria monocytogenes和Herpes simplex virus2中的哪一种或哪几种。本发明专利技术为中枢神经系统感染提供准确而迅速的病原学诊断，具有很高的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种基于PCR和nanopore测序检测脑脊液感染哪些病原体的方法
本专利技术属于生物信息学领域，具体涉及一种基于PCR和nanopore测序检测脑脊液感染哪些病原体的方法。
技术介绍
脑膜炎是严重威胁生命的脑膜和蛛网膜下腔炎症，由于它们在解剖学上的接近，炎症也可能累及大脑皮质和脊髓，需要立即就医和处理。脑膜炎症会引起血管痉挛，并可能导致脑小动脉和动脉的血栓形成以及可能的脑静脉阻塞。细菌和嗜中性粒细胞的多种炎性产物可穿过血脑屏障，引起神经元坏死或压迫颅神经。脑膜炎在世界范围内发生，并在各个年龄段的个体中发展，并导致高的发病率和死亡率。脑膜炎病原体包括细菌、真菌、病毒等，传统培养的方法周期长、灵敏度低，并且常规临床微生物实验室不能培养病毒，不能完全满足临床的需求。准确而迅速的检测中枢神经系统感染哪些病原体，对于临床工作具有体重要的应用价值。Nanopore测序为单分子实时测序技术，具有低成本、高通量、非标记和测序长度长、快速等优势。
技术实现思路
本专利技术的目的是检测中枢神经系统是否感染Enterov本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量检测若干中枢神经系统分别感染何种病原体的方法，包括如下步骤：/n(1)获得10种病原体的marker基因；/n10种病原体分别为Enterovirus、Lymphocytic choriomeningitis virus、Neisseriameningitidis、Cytomegalovirus、Mycobacrterium tuberculosis、Nocardia Farcinica、Herpes simplex virus 1、Human herpesvirus 6、Listeria monocytogenes和Herpessimplex virus2；/n(2)完成步骤(...

【技术特征摘要】
1.一种高通量检测若干中枢神经系统分别感染何种病原体的方法，包括如下步骤：
(1)获得10种病原体的marker基因；
10种病原体分别为Enterovirus、Lymphocyticchoriomeningitisvirus、Neisseriameningitidis、Cytomegalovirus、Mycobacrteriumtuberculosis、NocardiaFarcinica、Herpessimplexvirus1、Humanherpesvirus6、Listeriamonocytogenes和Herpessimplexvirus2；
(2)完成步骤(1)后，分别合成用于扩增10种病原体marker基因的特异引物对且各个特异引物对的靶序列长度为400-600bp；每个特异引物对由上游引物和下游引物组成；
(3)完成步骤(2)后，分别以来源于中枢神经系统的待测组织的cDNA为模板，采用步骤(2)合成的10个特异引物对进行多重PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(4)完成步骤(3)后，将所有PCR扩增产物混合，进行Nanopore扩增子测序，得到测序数据；
(5)完成步骤(4)后，将测序数据分别与10种病原体marker基因进行比对，进行如下判断：如果测序数据与某病原体的marker基因匹配，则相应的中枢神经系统感染该病原体；如果测序数据与某病原体的marker基因不匹配，则相应的中枢神经系统未感染该病原体；
所述方法用于非疾病的诊断与治疗。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，获得10种病原体的marker基因的步骤依次如下：
(1-1)从数据库下载所述10种病原体的CDS序列；
(1-2)将所有CDS序列进行两两间的相互比对，去除比对上的基因；
(1-3)去除600bp以下的CDS序列；
(1-4)使用minimap2与细菌、寄生虫、真菌和人的基因组序列进行比对，去除能比对上多个物种的CDS序列；
(1-5)根据每种病原体保留的序列数目进行marker筛选，获得marker基因；筛选原则为：如果该病原体仅有一条序列，则直接选择作为marker基因；如果该病原体有多条序列，进一步与NT数据库进行比对去除重复，之后随机选择一条作为marker基因。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：Enterovirus的marker基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；Lymphocyticchoriomeningitisvirus的marker基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；Neisseriameningitidis的marker基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；Cytomegalovirus的marker基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；Mycobacrteriumtuberculosis的marker基因的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；NocardiaFarcinica的marker基因的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；Herpessimplexvirus1的marker基因的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示；Humanherpesvirus6的marker基因的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示；Listeriamonocytogenes的marker基因的核苷酸序列如SEQIDNO:9所示；Herpessimplexvirus2的marker基因的核苷酸序列如SEQIDNO:10所示。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，
用于扩增Enterovirus的marker基因的特异引物对由SEQIDNO:11所示的单链DNA分子和SEQIDNO:12所示的单链DNA分子组成；
用于扩增Lymphocyticchoriomeningitisvirus的marker基因的特异引物对由SEQIDNO:13所示的单链DNA分子和SEQIDNO:14所示的单链DNA分子组成；
用于扩增Neisseriameningitides的marker基因的特异引物对由SEQIDNO:15所示的单链DNA分子和SEQIDNO:16所示的单链DNA分子组成；
用于扩增Cytomegalovirus的marker基因的特异引物对由S...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宏斌，王辉，
申请(专利权)人：北京大学人民医院，
类型：发明
国别省市：北京;11