猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，包括5对猪星状病毒基因型特异性组合引物(CP)和1条通用引物(UP)；还包括PCR反应液、PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品；PCR标准品由PAstV1标准品、PAstV2标准品、PAstV2标准品、PAstV3标准品、PAstV4标准品、PAstV5标准品组成。本发明专利技术还同时提供了试剂盒在富集多重PCR检测5种猪星状病毒基因型快速诊断中的应用。

【技术实现步骤摘要】
猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒
本专利技术属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种同时检测所有已知猪星状病毒基因型的多重PCR快速诊断试剂盒，可在同一个反应管内同时检测所有已知猪星状病毒基因型，适用于临床及科研中对猪星状病毒的快速检测。
技术介绍
星状病毒病是在全球流行的一种感染对象范围较广的疾病，可感染人，也可感染动物。猪星状病毒病是由猪星状病毒(PorcineAstrovirus，PAstV)引起的一种以生猪腹泻为主要症状的流行性疾病。PAstV属于星状病毒科(Astroviridae)，哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus)。星状病毒为单链正股RNA病毒，病毒颗粒外表有5～6个突起结构，处理后呈典型星状结构，因此被命名为星状病毒。星状病毒基因组长度大小不一(6.8kb～7.3kb)，但结构基本相同，主要包括：5′非编码区、三个阅读开放框(ORF1a、ORF1b、ORF2)、3′非编码区以及一个约30bp的Poly(A)尾。猪星状病毒作为一种单链RNA病毒，具有较高的遗传变异性。随着生物测序技术的不断发展，越来越多的新型毒株被发现，猪星状病毒也由原来的1种基因型发展到现在5种基因型(PAstV1～PAstV5)，其中PAstV2～PAstV5均到2010年以后才被发现，不同基因型序列差异很大，彼此同源性在40％-46.6％之间。目前对猪星状病毒诊断手段主要为电镜观察、免疫荧光、ELISA，但是这些手段价格昂贵、操作繁琐，不适用猪星状病毒临床检测。随着分子生物学的发展，PCR技术开始流行，尤其是多重PCR以其灵敏度高、快速高效等优点被广泛应用于病毒检测。关于猪星状病毒的多重PCR研究报道不少，但大多只是检测猪星状病毒的存在，无法判断病毒基因型。少量关于猪星状病毒基因型多重PCR研究，或仅仅是针对其中3～4个基因型，或需两组不同多重PCR，且灵敏度不是很高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，即，提供一种同时特异灵敏地检测所有已知猪星状病毒基因型感染的靶标富集多重PCR快速诊断试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒(富集多重PCR检测5种猪星状病毒基因型快速诊断试剂盒)，其为同时特异灵敏地检测所有已知猪星状病毒基因型感染的靶标富集多重PCR快速诊断试剂盒，该试剂盒包括5对猪星状病毒基因型特异性组合引物(CP)和1条通用引物(UP)；所述5对猪星状病毒基因型特异性组合引物为：PAstV1-F-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACACAGAAGAGCAACTCCATTACATT-3’PAstV1-R-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACGTTGACGGATTGCTGGT-3’PAstV2-F-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACTGARTGGGARGARATGAGYGA-3’PAstV2-R-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAATGGTTCTGGTCCCGCTTC-3’PAstV3-F-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAACTGTTCAACAGGGTAAGTGGT-3’PAstV3-R-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAAGGTCCATCATGGAGTAGGTAAT-3’PAstV4-F-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAGGATTTACAGTTGGCCCAGA-3’；PAstV4-R-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAAAAGCCTGTCCATCTGCCT-3’PAstV5-F-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACATGTYTCCACYTCAGTTGA-3’PAstV5-R-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGATCAGAGCCAACACGAGCC-3’1条通用引物为：UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGA-3’。说明：所述每对猪星状病毒基因型特异性组合引物均在病毒基因型特异性引物序列的5′端均连一段共同的通用引物序列，上述带下划线的序列，指共同的通用引物序列。作为本专利技术的猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒的改进，该试剂盒包括a)PCR反应液、b)标准品、c)阳性对照品、d)阴性对照品、e)引物。所述PCR反应液包含PCR反应缓冲液，耐热DNA聚合酶和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物。所述PCR反应缓冲液含有缓冲液，氯化镁混合物。所述PCR标准品由PAstV1标准品、PAstV2标准品、PAstV3标准品、PAstV4标准品和PAstV5标准品组成；所述PAstV1标准品序列如SEQIDNO:1所述，所述PAstV2标准品序列如SEQIDNO:2所述，所述PAstV3标准品序列如SEQIDNO:3所述，所述PAstV4标准品序列如SEQIDNO:4所述，所述PAstV5标准品序列如SEQIDNO:5所述。所述阳性对照品为：含PAstV1、PAstV2、PAstV3、PAstV4和PAstV5这五种猪星状病毒基因型的阳性质粒混合品(每种病毒浓度约为300ng/μL)。所述阴性对照品为灭菌双蒸水ddH2O。所述引物为5对猪星状病毒基因群组特异性组合引物和1对通用引物，序列如表1。表1、本专利技术中所设计的PCR引物在本专利技术中，5对猪星状病毒基因型特异性组合引物的上下游引物和一条通用引物可同管包装。本专利技术的同时特异检测所有已知猪星状病毒基因型感染的富集多重PCR快速诊断试剂盒保存于-20度。本专利技术的试剂盒能用于检测猪星状病毒5个基因型PAstV1、PAstV2、PAstV3、PAstV4和PAstV5。本专利技术试剂盒的使用方法：每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。病毒样品核酸提取和反转录PCR：根据产品使用说明书，用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(AXYGEN)从猪粪样本中提取病毒核酸。核酸样品反转录PCR：取5μL提取好的核酸样品(DNA/RNA)，加入随机引物后经热变性后进行反转录实验，反应条件和程序参照Vazyme公司的HiScriptll1stStrandcDNASynthesisKit说明。反应后的cDNA放入-20℃冰箱保存待后续检测。病毒的检测：取1.0μL已抽提的待测样品核酸cDNA为模板进行多重PCR反应，其中7.5μL2×VazymeMix，PAstV1～V5的上下游引物终浓度各为20nM，通用引物UP终浓度为500nM；双蒸水补足至15μL。扩增程序为：95℃3min；10个循环：95℃30s、58℃30s、72℃30s；再加上35个循环：95℃30s、65℃30s、72℃30s；最后72℃5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：/n包括如下5对猪星状病毒基因型特异性组合引物：/nPAstV1-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACACAGAAGAGCAACTCCATTACATT/nPAstV1-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACGTTGACGGATTGCTGGT/nPAstV2-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACTGARTGGGARGARATGAGYGA/nPAstV2-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAATGGTTCTGGTCCCGCTTC/nPAstV3-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAACTGTTCAACAGGGTAAGTGGT/nPAstV3-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAAGGTCCATCATGGAGTAGGTAAT/nPAstV4-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAGGATTTACAGTTGGCCCAGA/nPAstV4-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAAAAGCCTGTCCATCTGCCT/nPAstV5-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACATGTYTCCACYTCAGTTGA/nPAstV5-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGATCAGAGCCAACACGAGCC。/n...

【技术特征摘要】
1.猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：
包括如下5对猪星状病毒基因型特异性组合引物：
PAstV1-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACACAGAAGAGCAACTCCATTACATT
PAstV1-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACGTTGACGGATTGCTGGT
PAstV2-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACTGARTGGGARGARATGAGYGA
PAstV2-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAATGGTTCTGGTCCCGCTTC
PAstV3-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAACTGTTCAACAGGGTAAGTGGT
PAstV3-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAAGGTCCATCATGGAGTAGGTAAT
PAstV4-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAGGATTTACAGTTGGCCCAGA
PAstV4-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAAAAGCCTGTCCATCTGCCT
PAstV5-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACATGTYTCCACYTCAGTTGA
PAstV5-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGATCAGAGCCAACACGAGCC。


2.根据权利要求1所述的猪...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜永厚，韩寅卓，文丹，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33