一种羊痘病毒属病毒通用Cycleave荧光PCR检测方法技术

本发明专利技术提供一种可同时检测羊痘病毒属牛结节性皮肤病、山羊痘与绵羊痘的Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法。本发明专利技术所提供的引物对和探针组，其正向引物的序列为SEQID NO：1；反向引物的序列为SEQ ID NO：2；探针的序列为SEQ ID NO：3，且探针的第8位为RNA碱基。本发明专利技术所提供的Cycleave荧光PCR检测羊痘病毒属病毒的引物、探针及方法具有检测灵敏度高、特异性好、高通量和操作简便的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种羊痘病毒属病毒通用Cycleave荧光PCR检测方法
本专利技术属羊痘病毒属病原微生物检测
，具体涉及一种可同时检测羊痘病毒属牛结节性皮肤病、山羊痘与绵羊痘的Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法。
技术介绍
牛结节性皮肤病病毒(Lumpyskindiseasevirus，LSDV)、山羊痘病毒(Goatpoxvirus,GTPV)、绵羊痘病毒(Sheeppoxvirus,SPPV)同为羊痘病毒属(Capripoxvirus，CaPV)成员，该三种病毒都是家养反刍动物中须防控的重要疫病，已在世界范围内对其流行地区的反刍动物生产和贸易造成巨大经济损失。牛结节性皮肤病是一种传入性外来动物疫病，我国在2019年8月于新疆伊犁哈萨克自治州首次确诊该病。2020年6月来，牛结节性皮肤病在我国境内迅速蔓延，在福建、江西、广东、安徽、浙江等省相继报告检测到了该病。牛结节性皮肤病患牛表现为皮肤、粘膜上广泛性的结节样病变，可致奶牛产奶量下降、公牛短暂或永久不育、怀孕牛流产、皮革损坏以及继发感染导致死亡，其发病率5-45％，病死率最高可达10％，严重威胁我国养牛业持续健康发展。山羊痘和绵羊痘并称羊痘，是所有动物痘病中危害最为严重的一种，数年来一直在我国部分地区持续流行，2020年山西、内蒙、宁夏等多地报道发生。该病临床症状为发热，无毛或少毛部位的皮肤或黏膜发生红斑、丘疹、疱疹、水泡等，发病率50％～80％，发病后成年羊死亡率达40％，羔羊死亡率可达100％，严重影响羊肉和羊毛质量。目前，在我国牛结节性皮肤病暂定为二类动物疫病，山羊痘和绵羊痘为一类动物疫病，三者均为世界动物卫生组织(OIE)法定报告疾病。通过发热、皮肤或黏膜结节(或丘疹)、淋巴结肿大等临床症状可初步诊断羊痘病毒属引起的疾病，但其确诊依赖实验室检测，特别是与症状相似的口蹄疫、羊口疮、蓝舌病等常见反刍动物疫病进行区分时，此外还存在无症状隐性感染情况。开发快速、准确、简便的检测方法是防控的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可同时检测羊痘病毒属牛结节性皮肤病、山羊痘与绵羊痘的Cycleave荧光PCR引物对、探针，以及应用该引物对和探针的检测方法。本专利技术首先提供一种检测羊痘病毒属病毒的引物对和探针，具体序列信息如下：羊痘病毒属检测正向引物CaPVforward：5′-TGGAAATRGATCCACCAGTTAAAG-3′(SEQIDNO：1)羊痘病毒属检测反向引物CaPVreverse：5′-TCGMACTAGCGAACATGGAA-3′(SEQIDNO：2)羊痘病毒属检测探针CaPVprobe：其中，检测探针CaPVprobe的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团Eclipse标记，下滑线位置为标记的RNA碱基位点；简并碱基M＝A/C；R＝A/G。上述引物和探针用于制备检测羊痘病毒属病毒的Cycleave荧光PCR检测体系。本专利技术还提供一种检测羊痘病毒属病毒的Cycleave荧光PCR方法，包括如下的步骤：1)Cycleave荧光PCR反应体系配制反应液每管25μL，含有2×Cycleave荧光PCR反应液12.5μL，5pmol/μL的CaPVforward和CaPVreverse各1μL，5pmol/μL的CaPVprobe1μL，双蒸水7.5μL，待检测样品DNA模板2μL；2)Cycleave荧光PCR反应体系扩增检测反应条件设置为：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s收集FAM信号，共40个循环；3)结果判定待检样品无Ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；待检样品Ct值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，结果判为阳性。本专利技术所提供的Cycleave荧光PCR检测羊痘病毒属的引物、探针及方法，具有如下的技术优点：1)灵敏度高：扩增模板的最低检出限可达4.98×100copies/μL，约合10copies/反应；2)特异性好：采用所筛选的引物和探针会特异性针对羊痘病毒属病毒基因组产生荧光扩增信号，经验证对常见的口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、蓝舌病病毒、羊口疮病毒等相关反刍动物疫病病毒，均无交叉反应；3)快速高通量：检测速度快，加入样品后40分钟内即可完成整个扩增检测过程，且根据荧光定量PCR仪的检测孔数量，可以一次性实现96～384个样品的同步检测；4)操作简便：配置好的Cycleave荧光PCR反应体系，置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。附图说明图1：本专利技术扩增CaPVORF028基因部分序列的引物和探针设计示意图(引物探针设计区域由方框圈出)。图2：阳性质粒制备电泳结果图，其中泳道1:500bpmarker；泳道2-4：pUC18-T-ORF028。图3：Cycleave荧光PCR灵敏度试验结果图，其中1：工作标准品1；2：工作标准品2；3：工作标准品3；4：工作标准品4；5：工作标准品5；6：工作标准品6；7：工作标准品7；8：工作标准品8；9：工作标准品9；10：阴性对照。图4：Cycleave荧光PCR标准曲线结果图，其中1：工作标准品1；2：工作标准品2；3：工作标准品3；4：工作标准品4；5：工作标准品5；6：工作标准品6；7：工作标准品7；8：工作标准品8。图5：Cycleave荧光PCR特异性试验结果图，其中1：阳性对照；2：O型/A型口蹄疫病毒；3：牛病毒性腹泻-黏膜病病毒与牛传染性鼻气管炎病病毒；4：羊口疮病毒；5：蓝舌病病毒；6：健康牛来源皮肤组织；7：健康牛来源血液；8：健康牛来源唾液；9：健康山羊来源皮肤组织；10：健康山羊来源血液；11：健康山羊来源唾液；12：健康绵羊来源皮肤组织；13：健康绵羊来源血液；14：健康绵羊来源唾液；15：阴性对照。具体实施方式Cycleave荧光PCR作为一种荧光定量PCR检测技术，是采用一对引物和一个嵌合有RNA位点的DNA探针扩增模板，当探针与互补的目标DNA杂交时，在RNA位点连接处切割探针，产生标记荧光，通过实时监测荧光信号实现检测目的。其检测具有特异、敏感、快速及荧光背景低、信噪比高等优势，并可识别单核苷酸位点多态性(SNP)。为了对本专利技术的技术特征、目的和效果有更清楚的理解，现对照附图详细说明本专利技术的具体实施方式。实施例1：引物及探针的筛选与设计羊痘病毒属(Capripoxvirus，CaPV)包含牛结节性皮肤病病毒(Lumpyskindiseasevirus，LSDV)、山羊痘病毒(Goatpoxvirus，GTPV)和绵羊痘病毒(Sheeppoxvirus，SPPV)，已有研究显示三种病毒间基因同源性可达95％以上，同源性较高。为了避免检测该属病毒时出现假阴性，首先从N本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测羊痘病毒属病毒的引物对和探针，其特征在于，所述的其中引物对，其正向引物的序列为SEQ ID NO：1；反向引物的序列为SEQ ID NO：2；探针的序列为SEQ ID NO：3，且探针的第8位为RNA碱基。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测羊痘病毒属病毒的引物对和探针，其特征在于，所述的其中引物对，其正向引物的序列为SEQIDNO：1；反向引物的序列为SEQIDNO：2；探针的序列为SEQIDNO：3，且探针的第8位为RNA碱基。


2.如权利要求1所述的引物对和探针，其特征在于，所述的探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团Eclipse标记。


3.权利要求1所述的引物对和探针在制备检测羊痘病毒属病毒的Cycleave荧光PCR检测制品中的应用。


4.一种用于检测羊痘病毒属病毒的制品，其特征在于，所述的制品为Cycleave荧光PCR检测制品，其中包含有权利要求1所述的引物对和探针。


5.一种检测羊痘病毒属病毒的方法，其特征在于，所述的方法中使用权...

【专利技术属性】
技术研发人员：南文龙，陆游，陈义平，吴晓东，王永杰，哈达，特木尔巴根，巩明霞，李林，张永强，赵永刚，屈海龙，邹艳丽，张雨初，王志亮，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东;37