一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法技术

本发明专利技术公开了一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法，包含能扩增PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的两对特异性引物，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；所述引物序列为如下核苷酸序列：P1：SEQ ID NO：1；P2：SEQ ID NO：2；P3：SEQ ID NO：3；P4：SEQ ID NO：4。本发明专利技术一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法，具有快速、特异性强等优点，通过联合PCR技术可以快速、有效地鉴别PPV、JEV两种混合病毒，与单一PCR检测相比，具有省时、省力的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法
本专利技术涉及检测试剂领域，具体涉及一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法。
技术介绍
猪细小病毒病是由猪细小病毒(PPV)引起的一种猪的繁殖障碍病。以怀孕母猪发生流产、死产、产木乃伊为特征。猪流行性乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒(JEV)引起的猪繁殖障碍性疾病，主要以母猪流产、死胎和公猪睾丸炎为特征。在种猪场发生的繁殖障碍性疫病中，这两种疾病繁殖障碍性疾病往往会严重降低种猪的生产效率。生产上对种猪场繁殖障碍性疾病的摸底排查、临床诊断，为猪场制定免疫程序提供科学的理论依据具有重大的实践意义。目前对本病的诊断目前主要是PCR和血清学诊断方法。但是血清学方法不如PCR方法敏感性高，PCR方法大多都是单一PCR检测，要检测这两种病毒的混合感染需要分别进行PCR操作，因此相对比较繁琐。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是现有检测PPV、JEV两种病毒混合感染的方法为分别进行单一PCR检测操作，相对比较繁琐，目的在于提供一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法，可在同一体系中检测两种感染病毒的存在，能够大大的提高诊断效率。本专利技术通过下述技术方案实现：一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，包含能扩增PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的两对特异性引物，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；所述引物序列为如下核苷酸序列：P1：SEQIDNO：1；5'-GGGACCAGGCAACAGACAT-3'；P2：SEQIDNO：2；5'-CTGCGGTTTGAGCCATCA-3'；P3：SEQIDNO：3；5'-AGGCATCACATCAACCCG-3'；P4：SEQIDNO：4：5'-AAGGGAGCAACTGCGACA-3'。一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，包括10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/LdNTP4μL，25mmol/LMg2+溶液3.5μL，40μmol/LP1、P2混合物0.7μL，40μmol/LP3、P4混合物0.3μL，JEVcDNA1μL、PPVDNA1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，ddH2O11.6μL，其中JEVcDNA是JEV抽提后的RNA经过反转录后得到的cDNA。一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV试剂的制备方法，主要包括以下步骤：(1)PPV的NS1基因和JEV的NS1基因序列的选择：从GenBank数据库中下载已经发表的PPV-VRI-1株的NS1、JEV-WHe株的NS1基因序列，(2)根据选择的PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的靶序列，用PCR引物设计软件分别进行引物的设计，将设计的引物进行最佳配对筛选试验，得到2最佳引物：P1、P2及P3、P4，用全自动DNA合成仪进行引物的合成，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；所述引物序列为如下核苷酸序列：P1：SEQIDNO：1；5'-GGGACCAGGCAACAGACAT-3'；P2：SEQIDNO：2；5'-CTGCGGTTTGAGCCATCA-3'；P3：SEQIDNO：3；5'-AGGCATCACATCAACCCG-3'；P4：SEQIDNO：4：5'-AAGGGAGCAACTGCGACA-3'。一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的方法，主要包括以下步骤：(1)样品的处理；(2)病料样品RNA和DNA的提取；(3)二联PCR反应：采用25μLPCR反应体系；PCR反应体系的组成为：10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/LdNTP4μL，25mmol/LMg2+溶液3.5μL，40μmol/LP1、P2混合物0.7μL，40μmol/LP3、P4混合物0.3μL，JEVcDNA1μL、PPVDNA1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，去ddH2O11.6μL；PCR反应条件为：95.5℃，预变性5min；95℃，变性30s；53.3℃，退火30s；72℃，延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸5min，其中JEVcDNA是JEV抽提后的RNA经过反转录后得到的cDNA；(4)结果判定取二联PCR产物在琼脂糖凝胶上，电泳后在凝胶成像系统中观察拍照，以标准DNAmarker(D,L-2000)作参考；电泳后，若琼脂糖凝胶中同时出现2条核酸带，且片段大小分别为750bp和475bp，说明病料样品中同时含有PRV、JEV病毒；如果仅出现其中一个对应长度的核酸片段，则表明病料样品中只含有其中一种病毒；若不出现任何核酸片段，则表明病料样品中不含有PRV、JEV病毒。步骤(4)中，取5μl产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳30min后在凝胶成像系统中进行观察。步骤(3)中，JEV的cDNA的合成反应体系：5×PrimeScriptTM缓冲液2μL，PrimeScriptTMRT-EnzymeMixI0.5μL，40μmol/LSpecificdownprimer0.25μL，总RNA2μL，RNaseFreeddH2O5.52μL。本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本专利技术一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法，具有快速、特异性强等优点，通过联合PCR技术可以快速、有效地鉴别PPV、JEV三种病毒，与单一PCR检测相比，具有省时、省力的优点。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术实施例的限定。在附图中：图1为二联PCR的特异性实验结果图；图2为6份猪病料样品检测结果，其中M为D,L-2000(2000，1000，750，500，250，100)，其中1-6为6份临床猪病料。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不作为对本专利技术的限定。实施例1引物的设计(1)PPV、JEV基因靶序列的选择从GenBank数据库中下载已经发表的PPV-VRI-1株的NS1、JEV-WHe株的NS1基因序列作为两对引物的靶序列。(2)特异性引物的设计及合成将选择的PPV-VRI-1株的NS1基因、JEV-WHe株的NS1基因的靶序列分别输入primerpremier5.0软件和oligo6.0软件程序中联合进行引物设计，分别设计两种基因的特异性引物。PPV的NS1基因引物设计具体的要求为：G+C含量为55.6～57.9％，引物长度18～19nt，Tm值57本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，其特征在于，包含能扩增PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的两对特异性引物，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；/n所述引物序列为如下核苷酸序列：/nP1：SEQ ID NO：1；/nP2：SEQ ID NO：2；/nP3：SEQ ID NO：3；/nP4：SEQ ID NO：4。/n

【技术特征摘要】
1.一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，其特征在于，包含能扩增PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的两对特异性引物，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；
所述引物序列为如下核苷酸序列：
P1：SEQIDNO：1；
P2：SEQIDNO：2；
P3：SEQIDNO：3；
P4：SEQIDNO：4。


2.根据权利要求1所述的一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，其特征在于，包括10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/LdNTP4μL，25mmol/LMg2+溶液3.5μL，40μmol/LP1、P2混合物0.7μL，40μmol/LP3、P4混合物0.3μL，JEVcDNA1μL、PPVDNA1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，ddH2O11.6μL，其中JEVcDNA是JEV抽提后的RNA经过反转录后得到的cDNA。


3.一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV试剂的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)PPV的NS1基因和JEV的NS1基因序列的选择：从GenBank数据库中下载已经发表的PPV-VRI-1株的NS1、JEV-WHe株的NS1基因序列；
(2)根据选择的PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的靶序列，用PCR引物设计软件分别进行引物的设计，将设计的引物进行最佳配对筛选试验，得到2最佳引物：P1、P2及P3、P4，用全自动DNA合成仪进行引物的合成，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；
所述引物序列为如下核苷酸序列：
P1：SEQIDNO：1；
P2：SEQIDNO：2；
P3：SEQIDNO：3；
P4：SEQIDNO：4。


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【专利技术属性】
技术研发人员：曹洪志，李成贤，李雪梅，
申请(专利权)人：宜宾职业技术学院，
类型：发明
国别省市：四川;51