本发明专利技术提供了一种高通量液相芯片检测技术，利用Luminex液相芯片xTAG技术专有的通用标签，对ASFV、NiV、SVDV、VSV、SVV和FMDV进行定性分析，利用不同编码的荧光磁性微球与PCR产物结合可实现同时对六种猪病病毒核酸的特异性检测，根据MFI值确定所检测样本的阴阳性。本发明专利技术可为猪源病毒的检测与鉴定提供一种高通量新方法，可用于病原体的快速检测。本方法操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好、缩短检测周期，节约样本资源。降低检测成本，在临床救治、流行病学调查、猪病溯源与口岸检测等多方面都发挥着重要作用，拥有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测多种猪源性病原的液相芯片
本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种用于检测多种猪源性病原的液相芯片，能够同时特异性检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、尼帕病毒(NiV)、猪水疱病毒(SVDV)、水疱性口炎病毒(VSV)、塞尼卡谷病毒(SVV)和口蹄疫病毒(FMDV)的液相芯片。
技术介绍
ASFV、NiV、SVDV、VSV、SVV和FMDV是严重危害养猪业的病毒性疫病，也是我国动物防疫部门重点防疫的疫病。2018年非洲猪瘟传入中国，尼帕和南非型口蹄疫我国还没有相关报道。猪源性外来病能够通过国际间贸易交流、野生动物携带及昆虫媒介传入我国，一旦传入将会给我国养猪业带来严重的损失，甚至是公共卫生问题。我国的养猪业在世界排名前列，而且越来越规模化和集约化。这种养殖方式使猪群之间的接触几率大大增加，若未做好防疫工作会发生疫病混合感染的情况。与传统散养和小规模养殖相比，集约化养殖更易受到猪群间传染病的冲击。有效的检测方法是控制疫病的关键，检测技术还在不断的进步中,不断发展的分子生物学方法和基因检测技术,以及新的分析方法都将有益于检测技术的发展。随着分子生物学的快速发展，以PCR技术为基础的各种诊断技术成为动物疫病诊断领域主要的研究手段和病毒检测金标准。多重PCR高通量的优势是临床上检测混合病原感染的理想方法，但是在实验设计上较繁琐，要考虑电泳能够肉眼区分的PCR产物大小。而qPCR通过检测PCR过程中的荧光信号实现对靶分子的定量分析，相比于传统的PCR方法省略了电泳检测，但是因为荧光种类和仪器的限制，最多只能做到5重检测。液相芯片是一种具有高敏感性、高特异性、高通量优点的病原体检测技术平台，是在人类基因组计划完成后，开启后基因组时代的背景下研发出的新一代生物芯片检测技术。该技术的核心是将针对不同待测物的编码微球混合，再加入微量待测样本以及链霉亲和素-藻红蛋白(SAPE)，在悬液中靶分子特异性的与微球表面的捕获分子结合，通过液相芯片仪发出的红、绿激光来识别微球编码并检测微球上报告分子的荧光强度。理想状态下最多能够在一个检测孔内分析100种不同的病原，新开发的Luminex3D最多能检测病原多达500种。对应用于液相芯片检测方法的引物组合要求是引物必须高度特异。多重PCR是在一个反应管内同时扩增多种病原，要保证每对引物不会与其他病原发生非特异性扩增；在进行引物设计时要尽量避免发卡结构和引物二聚体的产生，尤其要避免上游引物与任何一条下游引物超过连续4个碱基互补，否则会造成假阳性信号。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于对ASFV、NiV、SVDV、VSV、SVV和FMDV同时进行特异性检测的引物组和液相芯片检测方法，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供用于ASFV、NiV、SVDV、VSV、SVV和FMDV的检测引物组，其中包含有如下的引物：1)用于检测ASFV的引物对，其序列信息如下：正向引物ASFV-F：5’-CAATCTTATCGATAAATTTCCATC-3’(SEQIDNO:1)、反向引物ASFV-R：5’-AGCAAAGGTAATCATCATCGC-3’(SEQIDNO:2)；2)用于检测NiV的引物对，其序列信息如下：正向引物NiV-F：5’-TCAAGAAACATCAGCAGGAAGG-3’(SEQIDNO:3)、NiV-R：5’-GACTGTCGGCCACTCTGTTCT-3’(SEQIDNO:4)；3)用于检测VSV的引物对，其序列信息如下：正向引物VSV-F：5’-CGAGAAGTTGCAGATGAGATGG-3’(SEQIDNO:5)、VSV-R：5’-AGAAGTGGAAGGCAGGGTTTT-3’(SEQIDNO:6)；4)用于检测SVV的引物对，其序列信息如下：正向引物SVV-F：5’-TTTTGAATATCCACGGCTCGAT-3’(SEQIDNO:7)、SVV-R：5’-TTACGTCTTCAAAGGTGCCAGA-3’(SEQIDNO:8)；5)用于检测FMDV的引物对，其序列信息如下：正向引物FMDV-F：5’-GACAAAGGTTTTGTTCTTGGTC-3’(SEQIDNO:9)、FMDV-R：5’-CAWCGCAGGTAAAGTGATCTG-3’(SEQIDNO:10)；6)用于检测SVDV的引物对，其序列信息如下：正向引物SVDV-F：5’-CCATCAGACACAATGCAAACT-3’(SEQIDNO:11)、SVDV-R：5’-CACGTGTCTCATATATAGTGTC-3’(SEQIDNO:12)；本专利技术的引物组用来制备用于检测多种猪源性病原的液相芯片，所述的动物病原为ASFV、NiV、SVDV、VSV、SVV和FMDV；本专利技术还提供一种用于检测多种猪源性病原的液相芯片制品，所述的动物病原为ASFV、NiV、SVDV、VSV、SVV和FMDV；所述的液相芯片制品中包含有上述的引物组，其中上游引物的5′端连接有与荧光微球上包被的anti-TAG序列互补的TAG序列；下游引物的5′端用生物素修饰。作为实施例的一种具体记载，其中所述ASFV、NiV、SVDV、VSV、SVV和FMDV上游引物序列5’端连接的TAG序列如下：SEQIDNO:13：5’-CTTTCTTAATACATTACAACATAC-3’、SEQIDNO:14：5’-TTAACAACTTATACAAACACAAAC-3’、SEQIDNO:15：5’-ATCTCAATTACAATAACACACAAA-3’、SEQIDNO:16：5’-ATACTTTACAAACAAATAACACAC-3’、SEQIDNO:17：5’-TTAATACAATTCTCTCTTTCTCTA-3’、SEQIDNO:18：5’-TTCTTCATTAACTTCTAATCTTAC-3’所述的TAG序列通过SpacerC12连接到上游引物的5′端。本专利技术还提供一种检测多种猪源性病原的液相芯片检测方法，是使用上述的修饰引物组进行多重PCR扩增。其中PCR反应体系为如下：2xPCRMix25μL，引物各0.75μL，待检测的核酸模板1.5μL，DNA/RNA-freeH2O补足至50μL。反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35循环；72℃延伸10min其一种具体步骤如下：1)使用上述的修饰引物组对待检测样品的核酸样品进行多重PCR扩增，扩增产物与6种荧光编码微球结合；在37-45℃下反应25-45min，对液相芯片反应产物进行检测，通过获得的MFI值；孵育温度和孵育时间分别为37℃和40min。2)根据判定标准，阴性对照的MFI值＜300时，实验成立；阳性样本MFI/阴性样本MFI值≥3，阴性对本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于非洲猪瘟病毒、尼帕病毒、猪水疱病毒、水疱性口炎病毒、塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒的检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组包含有如下的引物：/n1)用于检测ASFV的引物对，其序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；/n2)用于检测NiV的引物对，其序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；/n3)用于检测VSV的引物对，其序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；/n4)用于检测SVV的引物对，其序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；/n5)用于检测FMDV的引物对，其序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；/n6)用于检测SVDV的引物对，其序列为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于非洲猪瘟病毒、尼帕病毒、猪水疱病毒、水疱性口炎病毒、塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒的检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组包含有如下的引物：
1)用于检测ASFV的引物对，其序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2；
2)用于检测NiV的引物对，其序列为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4；
3)用于检测VSV的引物对，其序列为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6；
4)用于检测SVV的引物对，其序列为SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；
5)用于检测FMDV的引物对，其序列为SEQIDNO:9和SEQIDNO:10；
6)用于检测SVDV的引物对，其序列为SEQIDNO:11和SEQIDNO:12。
2.权利要求1所述的引物组在制备用于检测多种猪源性外来病的液相芯片中的应用。
3.一种用于检测多种猪源性病源的液相芯片制品，所述的动物病原为ASFV、NiV、SVDV、VSV、SVV和FMDV；其特征在于，所述的液相芯片制品中包含有权利要求1所述的引物组，其中上游引物的5′端连接有与荧光微球上包被的anti-TAG序列互补的TAG序列；下游引物的5′端用生物素修饰。
4.如权利要求3所述的液相芯片制...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘雨田，王莹，孙成友，迟田英，宋芳芳，戈胜强，任炜杰，王淑娟，于小静，吴晓东，王志亮，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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