小泛素样修饰的生物检测方法技术

本发明专利技术涉及一种小泛素样修饰的生物检测方法，通过构建小泛素样修饰蛋白与绿色荧光蛋白的基因融合体，将基因融合体与目标蛋白在细胞内的共表达再通过免疫沉降的方法收集目标蛋白，最后对目标蛋白进行单分子检测是否发生小泛素样修饰。该方法在免疫沉降收集到目标蛋白之后即进行洗脱并进行观察，实验步骤大大减少，可以缩短实验时间；此外，由于全内反射荧光显微镜只是在盖玻片上100nm范围内激发荧光分子，具有极高的灵敏度，可以对小泛素样修饰进行单分子水平上的检测，因此具有迅速、灵敏的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种。
技术介绍
小泛素样修饰是一种广泛存在于细胞内的蛋白质翻译后修饰行为。异常小泛素样修饰会导致神经退行性疾病、癌症、心脑血管疾病等多种疾病的发生。虽然小泛素样修饰调控了细胞内一系列关键生物学行为，但是在胞内目标蛋白中仅有一小部分发生小泛素样修饰，通常这一比例小于 5% (参 Creton, S.; Jentsch, S.Cell 2010，143，848_848el)。这种低丰度的现状极大限制了对小泛素样修饰的检测及生物学功能的研究。传统的主要是利用蛋白质印迹的方法来进行小泛素样修饰的鉴定。通常利用免疫沉降方法来富集被小泛素样蛋白修饰的靶标，然后再利用聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分离，接着进行转膜、封闭、抗体孵育、显影等多个步骤进行小泛素样修饰的鉴定(参Sarge，K.D.;Park-Sarge, 0.K.Methods Mol Biol 2009,590,265-77)。然而蛋白质印迹法需要进行一系列实验操作，实验步骤多，实验周期长，且所使用抗体的滴度和特异性对实验结果的影响较大，灵敏度不高，不利于广泛应用。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种快速、灵敏的。一种，包括如下步骤:扩增小泛素样修饰蛋白基因，在限制性内切酶的作用下，通过体外连接反应，将扩增的小泛素样修饰蛋白基因整合进含有绿色荧光蛋白基因的载体中，得到含有小泛素样修饰蛋白基因-绿色荧光蛋白基因的融合体基因；将2.5微克所述融合体基因与等量的目标蛋白基因转染进细胞内，并在细胞内共表达，得到含有小泛素样修饰蛋白-绿色荧光蛋白及目标蛋白的细胞，其中，所述细胞是人胚肾细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、非洲绿猴SV40转化的肾细胞或人成骨肉瘤细胞；将目标蛋白特异性的抗体与用蛋白A/G偶联的树脂进行孵育处理，制备抗体-树脂复合物；加入裂解液并破碎所述细胞，得到的细胞裂解液离心后取上清液；向所述抗体-树脂复合物中加入所述上清液，孵育，使目标蛋白与所述目标蛋白特异性抗体结合，接着清洗所述抗体-树脂复合物，之后使用与抗体-树脂复合物等体积的PH2.6的浓度为0.lmol/L的甘氨酸溶液洗脱所述抗体-树脂复合物，得到洗脱液；对所述洗脱液使用Tris缓冲液稀释100至500倍，得到稀释液；使用全内反射荧光显微镜在488nm激光器激发的条件下对所述稀释液进行单分子检测，若观察到有荧光分子表明目标蛋白发生小泛素样修饰；若没有观察到荧光分子则表明目标蛋白没有发生小泛素样修饰。在其中一个实施例中，所述将融合体基因与等量的目标蛋白基因转染进细胞是使用脂质体转染法。在其中一个实施例中，所述破碎细胞的步骤是将被裂解液重悬后的细胞置于超声波细胞粉碎机中，在35-40W的功率下，按照5s破碎-1Os休息-5s破碎的进行lmin。上述在破碎细胞并免疫沉降收集目标蛋白之后即洗脱并进行观察，实验步骤大大减少，可以缩短实验时间；此外，由于全内反射荧光显微镜只是在盖玻片上IOOnm范围内激发荧光分子，具有极高的灵敏度，因此可以对小泛素样修饰进行单分子水平上的检测，因此具有迅速、灵敏的特点。【附图说明】图1为一实施方式的的流程图；图2为小泛素样修饰蛋白-1与绿色荧光蛋白基因融合体酶切鉴定图，其中泳道I是pUC Mix Marker (MBI公司)，泳道2是基因融合体双酶切产物；图3为p53蛋白小泛素样修饰单分子检测结果图。【具体实施方式】下面主要结合附图及具体实施例对作进一步详细的说明。如图1所示，一实施方式的包括如下步骤:步骤S110，构建小泛素样修饰蛋白基因与绿色荧光蛋白基因的融合体基因，具体包括如下步骤:首先使用PCR技术扩增小泛素样修饰蛋白基因；然后在限制性内切酶的作用下，通过体外连接反应，将扩增的小泛素样修饰蛋白基因整合进含有绿色荧光蛋白基因的载体中，使得小泛素样修饰蛋白基因与绿色荧光蛋白基因融合在一起，从而得到含有小泛素样修饰蛋白基因-绿色荧光蛋白基因的融合体基因。步骤S120，融合体基因与目标蛋白基因在细胞内共表达，具体包括如下步骤:利用脂质体转染法将融合体基因与等量的目标蛋白基因转染进细胞内，并在细胞内共表达36-48小时后，即可得到含有小泛素样修饰蛋白-绿色荧光蛋白及目标蛋白的细胞。由于小泛素样修饰蛋白基因与绿色荧光蛋白基因融合在一起，所以可以通过荧光显微镜来检测小泛素样修饰蛋白的表达情况。在本实施方式中，转染所用的细胞是人胚肾细胞，此外，在其他实施方式中，还可以为人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、非洲绿猴SV40转化的肾细胞、人成骨肉瘤细胞。步骤S130,目标蛋白的免疫沉降,具体包括如下步骤:首先，将目标蛋白特异性的抗体与用蛋白A/G偶联的树脂进行孵育处理，制备抗体-树脂复合物。其次，使用0.5毫升裂解缓冲液重悬细胞，再利用超声波细胞粉碎机在冷水中进行破碎，破碎功率为35-40W，破碎过程中使用5s破碎-1Os休息-5s破碎的循环共破碎Imin ;离心破碎后的细胞裂解液，取上清液。最后向抗体-树脂复合物中加入上清液，在4°C孵育1-2小时，接着使用裂解缓冲液清洗抗体-树脂复合物数次，之后使用与抗体-树脂复合物等体积的0.lmol/L的甘氨酸溶液(pH值为2.6)洗脱抗体-树脂复合物两次，每次5分钟，得到洗脱液。步骤S140，小泛素样修饰的单分子检测，具体包括如下步骤:使用全内反射荧光显微镜在488nm激光器激发的条件下对洗脱液进行单分子检测，若观察到有荧光分子表明目标蛋白发生小泛素样修饰；若没有观察到荧光分子则表明目标蛋白没有发生小泛素样修饰。由于全内反射荧光显微镜只是在盖玻片IOOnm范围内激发荧光分子，具有极高的灵敏度，所需的样品量极少，若洗脱液中蛋白浓度较高，则在镜检之前需要先将洗脱物用Tris缓冲液稀释100至500倍，再进行观察。上述在破碎细胞并免疫沉降得到目标蛋白之后即进行洗脱并进行观察，实验步骤大大减少，可以缩短实验时间；此外，由于全内反射荧光显微镜只是在盖玻片上IOOnm范围内激发荧光分子，具有极高的灵敏度，因此可以对小泛素样修饰进行单分子水平上的检测，因此具有迅速、灵敏的特点。以下为具体实施例部分:构建小泛素样修饰蛋白-1基因与绿色荧光蛋白基因的融合体基因:利用5’ -gcagatctcgatgtctgaccaggaggcaaa-3’ /5’ _cggtcgacctaaccccccgtttgttcct_3’ 弓丨物对(SEQ IDNO:1及SEQ ID NO:2,宝生物工程(大连)有限公司合成)以及Eppendorf Mastercyclerpro梯度PCR仪扩增人源小泛素样修饰蛋白-1的基因(SEQ ID NO:3)，扩增步骤为:95°C反应3分钟，95°C变性30秒，58 °C反应30秒，72°C延伸30秒，其中变性/延伸循环30次，最后72°C反应2分钟；扩增产物用BglII和SalI限制性内切酶(宝生物工程(大连)有限公司)进行双酶切并用柱式小量胶回收试剂盒(上海华舜生物技术有限公司)回收；同时，用BglII和SalI双酶切包含有绿色荧光蛋白基因的载体pEGFP-C2 (Clontech公司)并用柱式小量胶回收试剂盒回收，再将两回收产物用T4连接酶(宝生物工程(大连)有限公司)进行连接，连接总本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小泛素样修饰的生物检测方法，其特征在于，包括如下步骤：扩增小泛素样修饰蛋白基因，在限制性内切酶的作用下，通过体外连接反应，将扩增的小泛素样修饰蛋白基因整合进含有绿色荧光蛋白基因的载体中，得到含有小泛素样修饰蛋白基因?绿色荧光蛋白基因的融合体基因；将2.5微克所述融合体基因与等量的目标蛋白基因转染进细胞内，并在细胞内共表达，得到含有小泛素样修饰蛋白?绿色荧光蛋白及目标蛋白的细胞，其中，所述细胞是人胚肾细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、非洲绿猴SV40转化的肾细胞或人成骨肉瘤细胞；将目标蛋白特异性的抗体与用蛋白A/G偶联的树脂进行孵育处理，制备抗体?树脂复合物；加入裂解液并破碎所述细胞，得到的细胞裂解液离心后取上清液；向所述抗体?树脂复合物中加入所述上清液，孵育，使目标蛋白与所述目标蛋白特异性抗体结合，接着清洗所述抗体?树脂复合物，之后使用与抗体?树脂复合物等体积的pH?2.6、浓度为0.1mol/L的甘氨酸溶液洗脱所述抗体?树脂复合物，得到洗脱液；对所述洗脱液使用Tris缓冲液稀释100至500倍，得到稀释液；使用全内反射荧光显微镜在488nm激光器激发的条件下对所述稀释液进行单分子检测，若观察到有荧光分子表明目标蛋白发生小泛素样修饰；若没有观察到荧光分子则表明目标蛋白没有发生小泛素样修饰。...

【技术特征摘要】
1.一种小泛素样修饰的生物检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 扩增小泛素样修饰蛋白基因，在限制性内切酶的作用下，通过体外连接反应，将扩增的小泛素样修饰蛋白基因整合进含有绿色荧光蛋白基因的载体中，得到含有小泛素样修饰蛋白基因-绿色荧光蛋白基因的融合体基因； 将2.5微克所述融合体基因与等量的目标蛋白基因转染进细胞内，并在细胞内共表达，得到含有小泛素样修饰蛋白-绿色荧光蛋白及目标蛋白的细胞，其中，所述细胞是人胚肾细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、非洲绿猴SV40转化的肾细胞或人成骨肉瘤细胞；将目标蛋白特异性的抗体与用蛋白A/G偶联的树脂进行孵育处理，制备抗体-树脂复合物； 加入裂解液并破碎所述细胞，得到的细胞裂解液离心后取上清液； 向所述抗体-树脂复合物中加入所述上清液，孵育，使目标蛋白与所述目标蛋白特异性抗体结合，接...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，杨用，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：