本发明专利技术为一种人PKM2抗原决定簇多肽、抗体及其在诊断试剂盒上的应用。本发明专利技术的PKM2抗原决定簇多肽，为正文陈述的多肽片段SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本发明专利技术的PKM2抗体，是由本发明专利技术的PKM2抗原决定簇多肽制备而成。本发明专利技术的PKM2抗体可应用于制备PKM2体外诊断试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及人PKM2抗原决定簇多肽、抗体及其在检测试剂盒上的应用。
技术介绍
丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸并产生一个ATP分子，是葡萄糖形成丙酮酸即糖酵解代谢最后一步反应的催化刹，也是糖酵解的限速酶之一。ATP、长链脂肪酸、乙酰-CoA、丙氨酸都对该酶有抑制作用；而果糖-1,6-二磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸对该酶与都有激活作用。丙酮酸激酶有四种同工酶——M1、M2、L和R型，在正常细胞中，它们主要以四聚体形式存在。丙酮酸激酶的表达有组织特异性，主要取决于细胞和组织的代谢情况。M1型丙酮酸激酶表达于能量消耗快速耗氧量大的组织，如肌肉和脑；L型丙酮酸激酶主要表达在糖异生旺盛的组织，如肝脏和肾脏；R型丙酮酸激酶主要在红细胞中表达；而M2型丙酮酸激酶主要在干细胞和胚胎细胞等快速增殖的细胞中特异表达。丙酮酸激酶L型和R型由相同的基因编码,但它们的表达由不同的启动子控制。丙酮酸激酶M1型和M2型则是M基因转录的同一mRNA的不同剪切产物,它们之间只有21个氨基酸的差别。研究发现：肿瘤的发生往往伴随着肿瘤部位丙酮酸激酶同工酶类别的转换。因为相比于ATP的合成，肿瘤细胞生物大分子的合成更加旺盛；为维持其自身的快速增殖，肿瘤细胞需要大量的糖代谢中间产物，比如3-磷酸甘油酸来用于氨基酸、磷脂的合成。因此，肿瘤发生往往表现为其来源的正常组织特异性丙酮酸激酶的变化，比如脑组织中PKM1，肝脏中PKL消失，而PKM2大量表达。在正常细胞中，PKM2主要以四聚体形式存在，然而在肿瘤细胞和组织中PKM2主要以二聚体形式存在。这两种存在形式的区别在于：四聚体形式下的PKM2与其底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）有很高的亲和力，而二聚体形式下PKM2与PEP亲和力却很低，这意味着四聚体的PKM2有很高的活性而PKM2二聚体则几乎无活性。肿瘤中主要以二聚体形式存在导致了肿瘤细胞内糖代谢中间体的高浓度，对肿瘤细胞的增殖具有重要的作用。肿瘤细胞内PKM2四聚体与二聚体的比例受细胞内1,6-二磷酸果糖浓度的调节而上下波动。1,6-二磷酸果糖是糖代谢的中间产物，由于肿瘤细胞PKM2的高度二聚体化，1,6-二磷酸果糖等中间产物无法进一步往下游产物转化，导致了1,6-二磷酸果糖的高浓度。而当1,6-二磷酸果糖浓度高到一定值时，抑制型二聚体将结合1,6-二磷酸果糖导致构形转变，重新聚合形成四聚体，使PEP催化生成丙酮酸，进而进入三羧酸循环供给能量。当1,6-二磷酸果糖浓度下降到最低值时，聚合的四聚体又将转化变成二聚体。肿瘤细胞PKM2的这种激活型四聚体和抑制型二聚体的相互转化在肿瘤适应环境不断改变的氧含量和营养条件中起着至关重要的作用，强大的糖代谢能力和PKM2的存在使肿瘤细胞能在低氧环境下生长并转移。多项研究已证实，肿瘤发生过程中PKM2通过调节糖代谢而影响肿瘤细胞的增殖和转移。用肌肉组织特异的M1型丙酸激酶取代M2型丙酮酸激酶，降低了胖瘤细胞糖酵解代谢的速率，减少了小鼠成瘤的几率和瘤块的体积；用抑制剂抑制M2型丙酮酸激酶的活性，也能降低糖酵解代谢的速率，抑制肿瘤细胞的生长，甚至杀伤种瘤细胞。在肿瘤发生过程中，由于肿瘤细胞的坏死和转移，肿瘤细胞中的PKM2能释放进入血液、尿液中，而消化道肿瘤的PKM2亦能随着肿瘤患者的粪便排出。此外,由于在正常状况下PKM2一般很难被检测到，只有在发生肿瘤时PKM2才能从坏死的肿瘤细胞中释放入血、尿，因此检测PKM2的量还可评估化疗效果的好坏以及肿瘤预后的判断。因此，检测PKM2可以用于肿瘤诊断、抗肿瘤疗效评价和预后判断。检测PKM2较理想的方法即是免疫测定，但前提是必须制备针对PKM2的特异性抗体，而M2型丙酮酸激酶与其他同工酶差别较小。制备特异识别PKM2而不结合其他丙酮酸激酶同工酶的抗体就成为研究的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种针对离体组织或体液或尿液PKM2水平，提供具有亲水、抗原性强、易于合成、特异性强的免疫源性的人PKM2抗原决定簇多肽，其为如下两种多肽片段之一，（1）Leu-Ala-Pro-Ile-Thr-Ser-Asp-Pro-Thr-Glu-Ala-Thr-Ala-Val-Gly-Ala（SEQ IDNO.1），即LAPITSDPTEATAVGA；（2）Ala-Thr-Leu-Lys-Ile-Thr-Leu-Asp-Asn-Ala-Tyr-Met-Glu-Lys-Cys-Asp-Glu-Asn-Ile-Leu-Trp-Leu-Asp-Tyr-Lys（SEQ ID NO.2），即ATLKITLDNAYMEKCDENILWLDYK。采用的优化措施包括：上述Leu-Ala-Pro-Ile-Thr-Ser-Asp-Pro-Thr-Glu-Ala-Thr-Ala-Val-Gly-Ala的N端或C端还具有Tyr。上述Ala-Thr-Leu-Lys-Ile-Thr-Leu-Asp-Asn-Ala-Tyr-Met-Glu-Lys-Cys-Asp-Glu- Asn-Ile-Leu-Trp-Leu-Asp-Tyr-Lys的N端或C端还具有Tyr。本专利技术的多肽片段SEQ ID NO.1是人PKM2蛋白C端的一段16个氨基酸的残基，在该肽段的N端、C端分别加上Tyr则组成多肽片段(3)、多肽片段(4)，如下：(3) Y-LAPITSDPTEATAVGA(4) LAPITSDPTEATAVGA-Y多肽片段SEQ ID NO.1在N端或C端加Tyr是为了通过BDB(双偶氮联苯胺二氯化物Bis-diazotizedbenzidine dichloride)交联到血兰蛋白(KLH)上作为抗原制备抗体，Tyr加在N端产生抗多肽C端抗体，Tyr加在C端，产生抗多肽N端抗体。本专利技术的多肽片段SEQ ID NO.2是人PKM2蛋白N端的一段25个氨基酸残基，在该肽段的N端、C端分别加上Tyr则组成多肽片段(5)、多肽片段(6)，如下：(5) Y-ATLKITLDNAYMEKCDENILWLDYK(6) ATLKITLDNAYMEKCDENILWLDYK-Y多肽片段SEQ ID NO.2在N端或C端加Tyr是为了通过BDB(Bis-diazotizedbenzidinedichloride) 交联到血兰蛋白(KLH)上作为抗原制备抗体，Tyr加在N端产生抗多肽C端抗体，Tyr加在C端，产生抗多肽N 端抗体。本专利技术的还提供一种特异性强的人PKM2抗体，由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2任意一种多肽片段制备而成的多克隆抗体或单克隆抗体，即提供能与人PKM2抗原决定簇多肽特异性结合的抗体。本专利技术的还提供一种人PKM2抗体在制备人PKM2体外检测诊断试剂盒上的应用。进一步的优化措施包括：上述剂盒采用SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2制备的任意一种人PKM2抗体作为包被抗体。上述试剂盒还包括结合抗体，结合抗体为另一种人PKM2抗体，与包被抗体的多肽来源不同。上述试剂盒还包括酶标记的二抗。上述两种多肽片段具有如下功能：①具有免疫原性，且具有亲水、抗原性强、易于合成。②与载体蛋白连接后作为抗原可刺激动物产生特异性的抗体。③用这两种多肽片段制备的抗体可特异性的与人PK本文档来自技高网...
【技术保护点】
人PKM2抗原决定簇多肽，其特征是：为如下两种多肽片段之一，1）Leu‑Ala‑Pro‑Ile‑Thr‑Ser‑Asp‑Pro‑Thr‑Glu‑Ala‑Thr‑Ala‑Val‑Gly‑Ala；2）Ala‑Thr‑Leu‑Lys‑Ile‑Thr‑Leu‑Asp‑Asn‑Ala‑Tyr‑Met‑Glu‑Lys‑Cys‑Asp‑Glu‑Asn‑Ile‑Leu‑Trp‑Leu‑Asp‑Tyr‑Lys。
【技术特征摘要】
1.人PKM2抗原决定簇多肽，其特征是：为如下两种多肽片段之一，1）Leu-Ala-Pro-Ile-Thr-Ser-Asp-Pro-Thr-Glu-Ala-Thr-Ala-Val-Gly-Ala；2）Ala-Thr-Leu-Lys-Ile-Thr-Leu-Asp-Asn-Ala-Tyr-Met-Glu-Lys-Cys-Asp-Glu-Asn-Ile-Leu-Trp-Leu-Asp-Tyr-Lys。2.根据权利要求1所述的人PKM2抗原决定簇多肽，其特征是：所述的Leu-Ala-Pro-Ile-Thr-Ser-Asp-Pro-Thr-Glu-Ala-Thr-Ala-Val-Gly-Ala的N端或C端还具有Tyr。3.根据权利要求1所述的人PKM2抗原决定簇多肽，其特征是：所述的Ala-Thr-Leu-Lys-Ile-Thr-Leu-Asp-Asn-Ala-Tyr-Met-G...
【专利技术属性】
技术研发人员：陶新博，张守涛，郭亚楠，
申请(专利权)人：浙江聚康生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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