一种附红细胞体重组表位抗原及其免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种附红细胞体重组表位抗原及其免疫检测试剂盒。本发明专利技术对猪附红细胞体HspA1蛋白进行了B细胞抗原表位的预测，筛选并截取HspA1蛋白的B细胞抗原表位富集区，通过原核表达获得重组HspA1表位富集区蛋白，用纯化后的重组HspA1表位富集区蛋白作为包被抗原，建立了检测猪附红细胞体的间接ELISA方法，构建了诊断试剂盒，为检测人和动物的猪附红细胞体感染以及猪附红细胞体的流行病学调查提供有效手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种附红细胞体重组表位抗原及其免疫检测试剂盒。
技术介绍
猪的附红细胞体病(eperythrozoonosis)是由附红细胞体(Mycoplasmaspp.)寄生于红细胞表面、血浆及骨髓内引起的一种传染性疾病。临床上以发热、贫血、黄疸为主要特征。该病分布范围广泛、感染宿主多，给人的健康和畜牧业的发展造成了巨大的危害。猪附红细胞体(Mycoplasmasuis)是其中危害最为严重的一种，可引起猪溶血性贫血，甚至危及生命，亦可引起慢性贫血，表现为仔猪生长缓慢、母猪不孕不育与免疫抑制。迄今附红细胞体无法进行体外培养，加之体积较小，形态多样，限制了对其特性和防控技术研究的深入开展。目前，主要采用猪血液涂片镜检、以全细胞可溶性蛋白为抗原建立的血清学方法，以及分子生物学方法对猪的附红细胞体病进行诊断，而这些诊断方法在临床应用时均存在一些缺点和不足。由于猪附红细胞体体积较小，直接用显微镜观察非常困难，而猪附红细胞体对红细胞具有亲嗜性，可以引起严重的红细胞损伤和变形，这常被用来进行诊断，然而，其他因素也可以引起红细胞的变形，比如涂片技术、渗透压改变等，因此血液镜检技术具有很大的片面性。分子生物学方法不仅费用高、检测周期较长，而且，由于一些引物特异性差，经常出现假阳性。目前已报道的猪附红细胞体血清抗体检测方法主要有补体结合试验(complementfixationtest,CFT)、间接血凝试验(indirecthemagglutinationassay,IHA)和酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)，其中ELISA法具有操作简便、灵敏性高、快速、易标准化等特点，已成为首选的常规诊断方法，所用抗原大多为常规的附红细胞体菌体可溶性抗原。然而，由于目前尚无附红细胞体的体外培养技术，难以获得大量抗原，使得ELISA检测方法受到极大的限制。热休克蛋白(heatshockproteins，Hsps)是生物界普遍存在的一类高度保守的蛋白质，其基因在进化过程中具有高度保守性，近年来不少学者应用其序列研究生物的基因型、进行疾病的分子流行病学调查和病原的系统进化关系分析。此外，该类蛋白还可作为主要的抗原蛋白，诱导宿主产生抗体，杀伤入侵的病原微生物。Hoelzle等(2007)运用血清蛋白组学(serologicalproteome)结合质谱分析技术，鉴定出6个猪附红细胞体功能蛋白，其中一个为Dnak样蛋白热休克蛋白A1(heatshockproteinsA1，HspA1)，HspA1是具有免疫原性的功能蛋白。HspA1属于热休克蛋白HSP70家族，分子大小为67ku，定位在猪附红细胞体胞浆及胞膜上，具有表面可接触性(surfaceaccessibility)、ATP酶(ATPase)活性及抗原性，可能参与对宿主红细胞的黏附。作者继而构建了猪附红细胞体DNA文库，对文库部分克隆进行鸟枪法测序，获得了全长为1830bp的HspA1蛋白编码基因序列，命名为猪附红细胞体a1基因。由于在猪附红细胞体中，密码子UGA编码色氨酸，而在大肠埃希菌(E.coli)中，UGA是终止密码子，如果进行原核重组表达HspA1蛋白，需要按照E.coli的密码子偏嗜性，克服翻译时UGA编码色氨酸的障碍，需按密码子的兼并性对a1基因核苷酸序列进行改造，然后进行全基因合成才可进行后续的研究。Hoelzle等(2007)对a1基因核苷酸序列改造后进行全基因合成，并利用原核表达的重组HspA1(recombinantHspA1,rHspA1)蛋白建立检测猪附红细胞体病的ELISA诊断技术，其敏感性和特异性等于或高于利用猪附红细胞体全细胞建立的ELISA技术。由于上述步骤不仅繁琐复杂，而且费用较高。此外，猪附红细胞体a1基因长达1830bp，不仅表达比较困难而且极易发生突变。因此，目前对a1基因进行克隆表达、用于免疫诊断的研究机构还非常少。抗原以抗原决定簇与相应抗体或淋巴细胞表面相应的受体特异性结合而激活特异的免疫应答。因此，抗原决定簇是免疫应答和免疫反应(反应原性)的物质基础。近年来，国内外开始尝试利用抗原表位预测工具进行抗原的表位预测，构建多表位抗原(multi-epitopeantigen)，即同时携带多个与目标抗原相关的表位及辅助性表位的抗原，来作为诊断抗原，目前在日本血吸虫、弓形虫等寄生虫，结核分枝杆菌、副猪嗜血杆菌等细菌，腺病毒等病毒中均已开始应用，取得了良好的效果。但迄今在附红细胞体上尚未见应用报道。目前，在附红细胞体方面，仅有一个基因所编码蛋白的B细胞抗原表位报道用生物信息学软件进行了预测一个基因所编码蛋白的B细胞抗原表位，而且没有进行后续的研究，这是由于在猪附红细胞体的基因组中，绝大部分编码蛋白的功能未知，即为假定蛋白，仅少数蛋白根据其序列同源性，预测出了其功能，比如：猪附红细胞体3-磷酸甘油醛脱氢酶样蛋白1(M.suisglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase-likeprotein1，MSG1)、DnaK样热休克蛋白A1(HeatShockProteinA1,HspA1)、GroEL、α-烯醇酶(α-Enolase)、丙酮酸脱氢酶(PyruvateDehydrogenase)和RNA解螺旋酶等，而且多数缺乏实验验证。目前研究最多的蛋白是HspA1、MSG1和α-Enolase。由于在猪附红细胞体中，密码子UGA编码色氨酸，而在大肠埃希菌(E.coli)中，UGA是终止密码子。因此，原核表达或真核表达时，国外均采用全基因合成，国内g1基因(MSG1的编码基因)采用全基因合成，a1基因和α-Enolase编码基因是避开TGA后选择了一个开放阅读框。由于上述现状，抗原表位预测相关技术迄今没有应用到附红细胞体上。国外，Hoelzle等(2007)对a1基因核苷酸序列改造后进行全基因合成，并利用原核表达的重组HspA1(recombinantHspA1,rHspA1)蛋白建立了检测猪附红细胞体病的ELISA诊断技术(HspA1整个蛋白)。国内，虽然，于龙政等(2012)利用原核表达系统表达了部分重组HspA1蛋白，但是其HspA1蛋白的编码序列仅仅是为了避免在大肠杆菌中终止，而选择了一个开放阅读框(0RF)，并没有考虑这一段序列所编码的蛋白是否为B细胞的抗原表位。目前，国内还没有学者运用重组HspA1(recombinantHspA1,rHspA1)蛋白建立检测猪附红细胞体病的ELISA诊断技本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种附红细胞体重组表位抗原rHspA1，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种附红细胞体重组表位抗原rHspA1，其特征在于，序列如SEQIDNo.1所示。
2.一种根据权利要求1所述的附红细胞体重组表位抗原的制备方法，其特征在于，
包括如下步骤：
从猪附红细胞体HspA1蛋白氨基酸序列中筛选B细胞抗原表位富集区，记为HspA1
表位区；
根据HspA1表位区的氨基酸序列从猪附红细胞体HspA1蛋白编码基因中筛选其编
码序列，记为a1-epi；
扩增a1-epi序列，并将回收产物与pMD18-T载体连接，得重组质粒pMD18-T-a1-epi；
对所述重组质粒pMD18-T-a1-epi质粒和pColdⅠ质粒分别用限制性内切酶BamHⅠ
和EcoRⅠ进行双酶切鉴定、胶回收，将a1-epi的胶回收产物与酶切pColdⅠ的胶回收产
物进行连接，得重组质粒pColdⅠ-a1-epi；
用所述重组质粒pColdⅠ-a1-epi转化大肠杆菌BL21菌株，得pColdI-a1-epi-E.coli
BL21菌株；
将pColdI-a1-epi-E.coliBL21菌株接种于LB液体培养基，于IPTG条件下诱导培
养，收集菌体并裂解，收集上清，即得附红细胞体重组表位抗原rHspA1。
3.根据权利要求2所述的附红细胞体重组表位抗原的制备方法，其特征在于，所
述HspA1表位区的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；所述a1-epi的核苷酸序列如SEQID
No....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈兆国，胡盼，米荣升，黄燕，陆珂，韩先干，王香平，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31