急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒的试剂包括Percp标记的抗CD45抗体、FITC标记的抗CD15抗体和PE标记的抗CD33抗体；本发明专利技术将所述试剂盒应用于所述检测方法，使用流式细胞术检测AML患者外周血及骨髓中的粒细胞(非干/祖细胞)的CD33抗原表达量，与传统的流式细胞术主要测定表达目标抗原细胞比例和进行定性分析相比，其有益效果在于：可快速、准确的实现对髓系白血病粒细胞CD33抗原表达的定量检测分析，检测结果可用于评估AML单克隆抗体疗法的疗效，有效的指导CD33单抗药物对AML的靶向治疗，在医学相关的检测领域中可发挥非常重要的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种急性髓系白血病(AcuteMyelocyticLeukemia,AML)粒细胞抗原表达量检测试剂盒。本专利技术还涉及急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测方法。
技术介绍
AML是造血系统的髓系原始细胞克隆性恶性增殖性疾病。它是一个具有高度异质性的疾病群，可以由正常髓系细胞分化发育过程中不同阶段的造血祖细胞恶性变转化。1976年首先将AML分为7型，即AML-M1至AML-M7。1991年根据细胞的免疫标志特点，又增加了AML-M0的诊断。目前，AML的治疗已经取得了很大进展，但化疗仍难以使患者治愈，多数患者在2年内仍会复发；由于缺乏对白血病细胞的靶向特异性，加大化疗剂量虽然能提高缓解率和无病生存期，但化疗毒性和相关死亡率也同时增加，因此血液学专家正积极寻找一些新的特异、安全和高效的治疗手段。随着化疗、造血干细胞移植、基因靶向治疗以及生物免疫治疗等多种治疗方法的发展，AML患者的完全缓解率及5年无病生存率均较前有所改善，但是仍有大部分患者出现耐药和复发，预后不良。单克隆抗体是有淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。因具有分子量小、毒副作用低、靶向性好等优点，近年来已成为肿瘤治疗用药的主要方式。在90％AML患者中，髓系白血病细胞表面有一相对特异、稳定、高表达的抗原CD33，而在正常造血多能干细胞及非造血细胞上却不存在这种糖蛋白。因此，CD33成为AML免疫治疗最适宜的靶抗原。使用CD33单克隆抗体联合化疗治疗16例复发、难治性AML患者，获得较高的完全缓解率，为部分患者行异基因造血干细胞移植提供了契机，可作为伴有CD33高表达复发或难治性AML患者的一种较为有效的治疗方法。美罗他格(Mylotarg,GemtuzumabOzogamicin,GO)是人源化抗CD33单克隆抗体与强效抗肿瘤抗生素——乙酰棘孢霉素偶联物，与髓系白血病细胞表面CD33抗原结合，进入细胞后释放棘孢霉素，对髓系白血病细胞有明显杀灭作用，用于治疗复发、难治的CD33+AML，获得良好疗效。GO与其它化疗药物联合应用治疗AML的临床试验正在进行中，如地西他滨(DAC)联合抗CD33单抗GO治疗难治性AML是安全可行的，尤其是对于一般情况差、不能耐受高剂量化疗或高剂量挽救化疗失败的患者，不失为一种新的治疗选择。使用该方法对2例难治性AML患者进行治疗后，均未出现肝静脉闭塞病(HepaticVeno-OcclusiveDisease,HVOD)及其它脏器功能损害表现。针对髓系白血病细胞表面CD33抗原的检测，现有技术中表面等离子体共振(SurfacePlasmonResonance,SPR)生物传感器作为一种新兴的生物检测技术，采用自组装膜技术，在传感芯片表面修饰抗CD33单克隆抗体，利用自行构建的SPR生物传感器检测人骨髓血液中髓系白血病细胞抗原CD33的表达，能够快速给出定量分析结果；但是这个方法的缺点也是明显的，即生物固化膜的不稳定性：物质分子在芯片表面吸附的不牢固，时间长会脱落，难以形成稳定的分子；固定量也难以控制；生物分子在金表面容易丧失活性，尤其是温度、酸碱度以及离子强度发生变化时更易失活；固定分子的取向也难以控制。作为现有技术中另一种检测方法，酶联免疫吸附剂测定(EnzymeLinkedImmμnosorbentAssay,ELISA)采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，通过酶与底物产生颜色反应，可进行定量测定。目前已建立了ELISA检测CD33单克隆抗体的方法，也开发出相应的商品化试剂盒，可以检测血清、血浆、组织匀浆液、细胞上清培养液等样本中的含量。但是ELISA方法仅可检测液体中可溶性蛋白的含量，即检测到髓系细胞分泌到血液或骨髓中的CD33抗体的含量而无法直接检测细胞表面的抗原表达量。因此利用ELISA方法检测到的CD33的抗体既可来源于AML患者正常的髓系前体细胞也可来源于异常的髓系白血病细胞，因此目前尚未将ELISA方法应用与临床评估AML患者的治疗效果上来。使用放射性核素标记方法也可测定每个细胞表面某种分子的数目，具有特异性强且灵敏度高的特点。放射性核素标记方法是将非标记抗原与放射性标记抗原同时竞争结合物(如抗体)上有限的结合位点，然后将结合抗原和未结合的游离抗原分离，用仪器测定放射性分布，利用标准曲线确定样本中待测物含量。但缺点是受核素半衰期的限制且需特别防止其放射性污染。目前尚未开发出用于CD33检测的放射免疫测定试剂盒。流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其它生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好、灵敏度高、环境友好、操作简便等优点。流式细胞术可以同时检测样本细胞的前向角散射(ForwardScatter,FSC)、侧向角散射(SideScatter,SSC)及多个荧光通道强度，通过选择合适的荧光抗体及正确的设门可以准确知道各群细胞的抗体表达情况，但传统的流式细胞术主要是测定表达目标抗原细胞所占的比例，以及对目标抗原的表达做定性分析，即判断抗体表达是否为阴性、弱阳性或强阳性，而很少对抗体表达做定量分析。综上所述，如何对髓系白血病粒细胞表面CD33抗原表达实现快速、准确的定量分析，成为当前亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中髓系白血病粒细胞表面CD33抗原表达定量分析技术的不足，提供了急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测试剂盒及检测方法，可快速、准确的实现对髓系白血病粒细胞CD33抗原表达的定量检测分析，有效的指导CD33单抗药物对AML的靶向治疗。为了实现上述技术目的，本专利技术实施例提供的一种技术方案为：一种急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测试剂盒，其试剂包括不同的荧光标记的抗CD45抗体、抗CD15抗体和抗CD33抗体。优选的，所述抗CD45抗体的荧光标记为Percp。优选的，所述抗CD15抗体的荧光标记为FITC。优选的，所述抗CD33抗体的荧光标记为PE。作为前述试剂盒的优选，所述试剂还包括红细胞裂解液和磷酸缓冲盐溶液(PhosphateBufferSaline,PBS)溶液。本专利技术实施例提供的另一种技术方案为：一种急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测方法，包括步骤如下：S1.采集检测标本：抽取AML患者的外周血或骨髓作为检测标本；S2.加入抗体及荧光染色：将所述检测标本中加入使用不同的荧光标记的抗CD45抗体、抗CD15抗体和抗CD33抗体并混匀；S3.流式细胞术检测：对所述检测标本进行孵育和红细胞裂解后，使用流式细胞术进行检测，设门分型得到CD15+CD33+的靶标细胞荧光强度；S4.测定标准曲线：使用流式细胞术在所述检测标本同等条件下测定QuantiBRITEPEBeads荧光，获得Beads(微球)平均荧光强度与抗原表达量的标准曲线；S5.计算抗原表达量：将所述靶标细胞荧光强度值代入标准曲线换算得到所述检测标本中髓系白血病粒细胞表面CD33平均抗原表达量。优选的，执行步骤S2前，对所述检测标本进行白细胞计数，将所述检测标本的细胞浓度调至3×本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测试剂盒，其特征在于，其试剂包括不同的荧光标记的抗CD45抗体、抗CD15抗体和抗CD33抗体。

【技术特征摘要】
1.一种急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测试剂盒，其特征在于，其试剂包括不同的荧光标记的抗CD45抗体、抗CD15抗体和抗CD33抗体。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗CD45抗体的荧光标记为Percp。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗CD15抗体的荧光标记为FITC。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗CD33抗体的荧光标记为PE。5.根据权利要求1至4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂还包括红细胞裂解液和磷酸缓冲盐溶液。6.一种急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测方法，其特征在于，包括步骤如下：S1.采集检测标本：抽取急性髓系白血病患者的外周血或骨髓作为检测标本；S2.加入抗体及荧光染色：将所述检测标本中加入使用不同的荧光标记的抗CD45抗体、抗CD15抗体和抗CD33抗体并混匀；S3.流式细胞术检测：对所述检测标本进行孵育和红细胞裂解后，使用流式细胞术进行检测，设门分型得到CD15+CD33+的靶标细胞荧光强度；S4.测定标准曲线：使用流式细胞术在所述检测标本同等条件下测定QuantiBRITEPEBeads荧光，获得Beads平均荧光强度与抗原表达量的标准曲线；S5.计算抗原表达量：将所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兴娟，王绪华，刘丽媛，秦晓明，王显凤，吴纯斌，梁超，陈忠，黄士昂，
申请(专利权)人：北京海思特临床检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11