本发明专利技术的目的是提供一种靶向激活慢性粒细胞白血病细胞蛋白激酶ＰＫＲ的寡核苷酸序列及携带有该寡核苷酸序列的逆转录病毒双表达载体。根据ＢＣＲ－ＡＢＬ ｂ３ａ２型ｍＲＮＡ融合位点左右各２０ｂｐ序列设计互补序列ＳＥＱ１和ＳＥＱ２，序列两端设计酶切位点，为防止转录过早终止，其中一对核苷酸Ｔ－Ａ被更换为Ｃ－ｇ，向急变期慢粒白血病Ｋ５６２细胞株转入这种特殊设计的重组逆转录病毒载体，可以在Ｋ５６２细胞内转录并与ＢＣＲ－ＡＢＬｍＲＮＡ杂交形成足够长度的双链ＲＮＡ，靶向激活ＰＫＲ，导致Ｋ５６２细胞的凋亡，而对机体内的正常细胞没有任何影响。将有效成分核苷酸序列制成临床所需的药物，能有效的治疗慢性粒细胞白血病，填补了医学方面的又一个空白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及治疗慢性粒细胞白血病的核苷酸序列，特别涉及一种靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸及其在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。
技术介绍
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)的发生是由于t(9；22)(q34；q11)所致的BCR-ABL融合基因编码产生了具有强烈酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，该融合蛋白激活PI3K(Phosphatidylinositol-3kinase)、Ras(Renin-angiotensin system)、STAT(Signal transducer and activatorof transcription)等信号转导通路，导致细胞恶性转化。目前治疗慢性粒细胞白血病的药物主要有各种化疗药，这些药物对全身各个系统的毒副作用较大，病人难以坚持。针对BCR-ABL融合蛋白的治疗取得了一些进展，尤其以STI571(商品名Glivec)的作用最为显著。然而，随着STI571的使用，临床出现耐药和对其先天不敏感的病人，为此，本专利技术立足对CML治疗现状研究，开发了新的治疗手段。 双链RNA依赖性蛋白激酶(Double-stranded RNA-dependent proteinkinase，PKR)是在哺乳动物细胞中表达、双链RNA调节的丝/苏氨酸蛋白激酶。它是细胞被某些病毒感染后反应性防御机制的一个关键性成分，在正常细胞的分化、转化及凋亡等生理、病理过程中也起着重要的调节作用。它能被干扰素诱导表达而被双链RNA所激活，激活过程包括双链RNA分子对PKR单体的募集及结合、两分子PKR单体同源二聚化及相互使对方磷酸化等一系列反应。PKR一经激活便具有很强的丝/苏氨酸蛋白激酶活性，高效地在蛋白合成启动因子eIF2的α亚单位上加上磷酸基团，并导致GDP-GTP交换因子eIF2B的隐蔽，从而抑制细胞内总体蛋白合成的启动。同时，活性PKR还激活促凋亡因子NF-κB、Caspase8等，两种效应共同作用导致细胞的凋亡。有资料表明，激活的PKR可诱导某些病毒感染细胞凋亡和多种正常细胞及病理细胞的凋亡，而被认为是一种抑癌蛋白。在肿瘤细胞中诱导PKR的表达及活性增高是目前肿瘤生物治疗研究领域的新动向，目前还没有通过激活PKR诱导急变期CML癌细胞凋亡，从而达到治疗目的基因的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸序列及携带有该寡核苷酸序列的逆转录病毒双表达载体，本专利技术的目的还在于提供该寡核苷酸序列在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。 具体技术方案如下一种靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸，其序列是SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。 一种载体，其特征是携带有如权利要求1所述的寡核苷酸，并引入了增强型绿色荧光蛋白基因。 逆转录病毒载体因其转染效率高而最常使用，也可使用其他的载体，如质粒、腺病毒等。 本专利技术的核心是通过设定的寡核苷酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，利用载体携带该寡核苷酸序列，为了能测定该序列、便于追踪观察，便于观察实验过程中病毒载体的感染效率，载体上还引入增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)，达到双表达的效果。向急变期慢粒白血病K562细胞株转入这种特殊设计的重组逆转录病毒载体，可以在K562细胞内转录并与BCR-ABLmRNA杂交形成足够长度的双链RNA，特异性激活PKR，PKR一经激活便具有很强的丝/苏氨酸蛋白激酶活性，高效地在蛋白合成启动因子eIF2的α亚单位上加上磷酸基团，并导致GDP-GTP交换因子eIF2B的隐蔽，从而抑制细胞内总体蛋白合成的启动。同时，活性PKR还激活促凋亡因子NF-κB、Caspase8等，两种效应共同作用导致细胞的凋亡，而对机体内的正常细胞没有任何影响。最重要的是在设计寡核苷酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO2时，为了为防止转录过早终止，其中一对核苷酸T-A(斜体下划线标记)被更换为C-g，实验证明单个碱基对的误配不会影响双链RNA对蛋白激酶PKR的激活，相反，如不误配，转录会过早终止，无法进行下一步的制备。同时SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的长短也必须限制，过长过短都将影响PKR的激活。 应用该策略治疗肿瘤有两个前提条件①靶细胞需有PKR蛋白的表达。②需要有效的手段激活肿瘤细胞内PKR，而正常组织细胞内PKR不受影响。首先，CML细胞中BCR-ABL融合基因的形成及继发性遗传学改变并没有影响PKR的生成。文献检索发现，无论是慢性期还是急变期的CML细胞都表达PKR。其次，由于PKR能被双链RNA分子所激活，而双链RNA分子的长度决定了其对PKR的激活能力(要求30-85bp)，太短不能有效结合两分子PKR，太长也会由于形成空间结构等原因影响对PKR的激活。由于CML细胞内有独特的BCR-ABL融合基因，会转录出BCR-ABL mRNA，因此我们针对此融合部位设计一段SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2(其中20nt针对BCR区，20nt针对ABL区)，在CML细胞内转录的反义RNA短片段将可以与BCR-ABLmRNA杂交形成40bp的双链RNA，进而特异性激活PKR；但在正常细胞内只能形成20bp(BCR区或ABL区)的双链RNA，长度不足以激活PKR，故对正常细胞没有影响。 本专利技术以慢性粒细胞白血病K562细胞作为实验模型，应用分子生物学、细胞生物学、实验血液学、实验动物学等方法，进行了一系列实验，实验证明了靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶PKR的逆转录病毒双表达载体对K562细胞的抑制作用。包含特定长度的基因序列，靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶PKR的逆转录病毒载体的构建和病毒包装和K562细胞感染。逆转录病毒载体因其转染效率高而最常使用，也可以选择其他的载体，如质粒、腺病毒等。 构建该寡核苷酸及载体所用的pMSCV-neo逆转录病毒载体购于美国BD公司，IRES2-EGFP质粒载体购于美国BD公司，pSilencer3.1-H1载体购自美国Ambion公司。根据BCR-ABL b3a2型mRNA(GenBank登陆号AJ131466)融合位点左右各20bp序列设计互补序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。序列两端设计酶切位点，为防止转录过早终止，其中一对核苷酸T-A(斜体下划线标记)被更换为C-g(单个碱基对的误配不会影响双链RNA对蛋白激酶PKR的激活)。该寡核苷酸均由上海生工生物工程技术服务有限公司人工合成，溶解后于-20℃保存备用。 具体来讲，制成携带特定序列、特定长度寡核苷酸的逆转录病毒载体大致可包括以下步骤 1)pH1-BCR-ABL40as重组质粒的构建及鉴定 2)pMSCVeGFP逆转录病毒载体的构建及鉴定 3)pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS重组逆转录病毒双表达载体的构建及鉴定 4)病毒包装及滴度测定 通过以上步骤制得病毒毒液命名为RV-GFP(pMSCVeGFP经过细胞包装获得的含有荧光蛋白基因的病毒液)、RV-40AS(pMSCVeGFP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶ＰＫＲ的寡核苷酸，其序列是ＳＥＱＩＤＮＯ１和ＳＥＱＩＤＮＯ２。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯文莉，曾建明，王小中，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。