ddPCR技术监测伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药的方法技术

本发明专利技术提供了一种ddPCR技术监测伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药的方法，及其在监控伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼治疗慢性粒细胞白血病过程中的应用。本发明专利技术首先对慢性粒细胞白血病患者外周血浆进行DNA抽提，再利用ddPCR技术检测其中ABL基因的耐药突变位点T315I，或PDGFRα基因的耐药突变位点T674I的突变情况，并以此判定该患者是否产生耐药。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学和生物
，具体地涉及可用于指导肿瘤治疗的分子检测技术，尤其是高灵敏度地检测外周血浆中ABL基因或PDGFRα基因位点突变的方法，及其在监控慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼产生继发性耐药等方面的应用。
技术介绍
慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是一种起源于造血干细胞的恶性增殖性疾病,以9号和22号染色体异位形成费城染色体(Ph)为特征，该异位形成一种新的BCR-ABL融合基因，此基因编码的融合型蛋白能导致髓系造血的异常克隆性增殖。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)的出现是CML治疗史上的一座里程碑，目前TKI成为新诊断的CML慢性期(CML-CP)患者的标准治疗方案。伊马替尼(imatinib)通过竞争性地与BCR-ABL激酶上的ATP结合位点结合，抑制其酪氨酸激酶活性，阻断激酶自身磷酸化及底物磷酸化水平，从而特异性地抑制BCR-ABL阳性细胞增生并诱导其凋亡，是首个成功治疗靶向抑制BCR-ABL的TKI，目前已成为CML患者的一线治疗方案，取得了良好的疗效，已经在许多国家得到越来越广泛的应用。大多数CML慢性期患者对伊马替尼有着显著的血液学和细胞遗传学缓解。但随着伊马替尼广泛的应用，临床上出现的耐药病例逐渐增多。绝大部分的伊马替尼耐药是由于BCR-ABL激酶位点突变造成的，该位点变异可能破坏伊马替尼和BCR-ABL的联系或者使激酶失去其非活性构象，进而导致下游有害的信号转导和细胞恶性克隆增生。突变主要分布在BCR-ABL激酶的如下4个簇：P-环簇、T315近侧簇、酶促反应簇和A-环簇，其中在P-环和T315I的突变作用最强，可完全阻断伊马替尼与ATP的结合。另外，BCR-ABL融合基因的扩增和过度表达导致酪氨酸激酶活性更强，使原有剂量的伊马替尼不足以控制。耐药可直接导致治疗失败，大大降低了伊马替尼的利
用价值。因此，对于BCR-ABL激酶位点突变进行实时监测，能够有效地指导CML患者用药。然而传统的需要以肿瘤组织的基因组DNA为模板，这为患者在治疗过程中的多次检测和实时监控带来了困难。血浆游离DNA(cfDNA)含有循环肿瘤DNA(ctDNA)，对血浆中游离DNA进行定量和定性的检测可反映出肿瘤的特征性变化，近年来的研究表明，血浆游离DNA可作为一个监控肿瘤负荷的可靠指标。cfDNA检测仅需少量外周血样本，操作简便，无创，可重复检测。研究还表明，血液中的游离DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，其主要成分是小片段的双链DNA，存在形式主要包括与DNA-蛋白质复合物形式或纯粹的游离形式。然而，由于血浆游离DNA在血液中含量极少，且有大量血源DNA干扰，即使采用高效的DNA富集手段进行分离纯化并配合高灵敏度的检测手段(如测序、数字PCR)，仍难以准确而可靠地检测出与肿瘤相关的游离DNA的具体种类和序列。例如，有文献报道，虽然大肠癌患者中循环游离DNA的平均含量(4771ng/ml)与健康人的平均含量(0.85ng/ml)存在显著差异，但是对于67例患者中癌胚抗原(CEA)的检测只有47％检测结果对诊断有意义。因此，虽然基于血液游离DNA的检测技术存为研发的焦点，但是本领域尚缺乏令人满意的、真正能够满足临床上的高灵敏度、高准确性和高可靠性的突变DNA检测技术。综上所述，本领域迫切需要一种能够基于非肿瘤组织，高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中肿瘤相关突变(如ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变)的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够用非肿瘤组织(如血液或血浆样品)检测患者ABL基因T315I，或PDGFRα基因T674I突变的方法。本专利技术的第一方面，提供了一种对基因耐药突变位点进行检测的方法，所述方法包括步骤：(1)提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本或血液样品；(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA
抽提物，其中对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液；(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含所述的耐药突变位点的扩增产物；和(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出基因耐药突变位点的突变形式和/或比例；且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL基因，或PDGFRα基因。在另一优选例中，所述的耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或PDGFRαT674I。在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血进行分离得到。在另一优选例中，所述的检测样本是血浆样本。在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血样本经预处理获得。在另一优选例中，所述的预处理包括：(a)将采集的外周血至于非肝素的抗凝管(如EDTA抗凝、和/或ACD抗凝的抗凝管))中；(b)经一级离心处理，去除沉淀，分离获得液相(血浆)；(c)对上一步骤的获得的液相进行二级离心，去除沉淀，分离获得液相作为用于提取DNA的检测样本。在另一优选例中，所述的一级离心包括选自下组的一个或多个条件：(b-i)2000-5000rmp；(b-ii)离心约1-15分钟；(b-iii)温度0-8℃，较佳地4±2℃。在另一优选例中，所述的一级离心包括选自下组的一个或多个条件：(c-i)10000-15000rmp；(c-ii)离心约5-30分钟；(c-iii)温度0-8℃，较佳地4±2℃。在另一优选例中，在步骤(3)中，所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为50～100ng。在另一优选例中，所述的方法是非诊断且非治疗性的。在另一优选例中，在ddPCR中，反应体系中含有PCR扩增引物对，以及用于检测突变位点的探针。在另一优选例中，ddPCR中所用的PCR扩增引物对为包含ABL T315I或PDGFRα T674I突变位点的特异引物对。在另一优选例中，所述的扩增引物对为用于扩增选自下组的位点的特异引物对：ABL T315I突变型、ABL T315I野生型、PDGFRα T674I突变型、PDGFRαT674I野生型。在另一优选例中，所述用于扩增ABL T315I的特异引物对的序列如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示。在另一优选例中，所述用于扩增ABL T315I的特异引物对的序列如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示。在另一优选例中，所述用于扩增PDGFRα T674I的特异引物对的序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。在另一优选例中，所述用于扩增、PDGFRα T674I的特异引物对的序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。在另一优选例中，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针。在另一优选例中，所述的突变型探针为FAM探针，所述的野生型探针为HEX探针；或所述的突变型探针为HEX探针，所述的野生型探针为FAM探针。在另一优选例中，所述的ABL T315I突变型FAM探针的序列如SEQ ID NO:1所示。在另一优选例中，所述的ABL 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对基因耐药突变位点进行检测的方法，其特征在于，包括步骤：(1)提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本或血液样品；(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其中对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20‑100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液；(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含所述的耐药突变位点的扩增产物；和(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出基因耐药突变位点的突变形式和/或比例；且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL基因，或PDGFRα基因。

【技术特征摘要】
1.一种对基因耐药突变位点进行检测的方法，其特征在于，包括步骤：(1)提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本或血液样品；(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其中对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液；(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含所述的耐药突变位点的扩增产物；和(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出基因耐药突变位点的突变形式和/或比例；且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL基因，或PDGFRα基因。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在ddPCR中，反应体系中含有PCR扩增引物对，以及用于检测突变位点的探针。3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的样本来自于慢性粒细胞白血病患者。4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述的抽提处理包括步骤：(2a)将血浆样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液；(2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合液；(2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得吸附有DNA的固相载体；(2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。5.一种基因耐药突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对；(b)RNA carrier；(c)使用说明书(如插页)，其中，所述说明书记载了权利要求1所述的方法，其中，所述的突变位点包括ABL T315I，或PDGFRαT674I。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：(d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针。7.一种基因耐药突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对；(b)RNA carrier；(c)使用说明书(如插页...

【专利技术属性】
技术研发人员：易静，许骋，吴云鸣，张桢珍，丁飞飞，楼敬伟，王潍博，李明峰，何志杰，张威浩，易村犍，
申请(专利权)人：上海宝藤生物医药科技股份有限公司，上海张江转化医学研发中心有限公司，上海宝藤医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31