本发明专利技术公开了一种利用羰基还原酶制备克唑替尼中间体的方法，以2’,6’‑二氯‑3’‑氟苯乙酮为底物，磷酸缓冲液为反应介质，加入羰基还原酶、辅因子及氢供体形成生物催化反应体系，发生生物催化反应生成(S)‑2’,6’‑二氯‑3’‑氟苯乙醇。本发明专利技术采用新型的羰基还原酶催化还原反应，具有生物催化剂使用量小、反应条件温和、反应时间短、收率高和光学纯度好等优势。
A reduction method for preparation of crizotinib using carbonyl intermediates
The invention discloses a method for preparing reductive crizotinib intermediates using carbonyl, 2 ', 6' 3 'two chlorine fluoroacetophenone as substrate, phosphate buffer solution as reaction medium, addition of carbonyl reductase, cofactor and hydrogen donor form biological catalysis system, generating biological catalysis the reaction of (S) 2', 6 '3' two chlorine - ethanol. The invention adopts a new carbonyl reductase catalytic reduction reaction, and has the advantages of small amount of biological catalyst, mild reaction condition, short reaction time, high yield and good optical purity.
【技术实现步骤摘要】
一种利用羰基还原酶制备克唑替尼中间体的方法
本专利技术涉及生物制药
，特别涉及一种利用羰基还原酶制备克唑替尼中间体的方法。
技术介绍
赛可瑞(Xalkori，克唑替尼)是由辉瑞公司研制的抑制Met/ALK/ROS的ATP竞争性的多靶点蛋白激酶抑制剂。分别在ALK、ROS和MET激酶活性异常的肿瘤患者中证实克唑替尼对人体有显著临床疗效。Xalkori是肿瘤药物研发史上最快速的药物之一，2011年在美国上市后引起轰动。克唑替尼的化学结构式如下：(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇是克唑替尼化学合成过程中一个重要的中间体。但目前主要以化学合成为主，但该方法步骤繁琐，产品收率低，污染大，不适于规模化生产(US7858643B2)。目前(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇的生物制备方法，在催化过程中需要使用昂贵的辅酶NADP和使用葡萄糖脱氢酶进行辅酶再生，不利于该中间体的廉价制备。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术存在的上述不足，提供一种利用羰基还原酶制备克唑替尼中间体的方法，方法简单易行，产品收率高，生产成本低、环保，从而满足克唑替尼的大规模工业化生产要求。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用羰基还原酶制备克唑替尼中间体的方法，以2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮为底物，磷酸缓冲液为反应介质，加入羰基还原酶、辅因子及氢供体形成生物催化反应体系，发生生物催化反应生成(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇。作为优选，所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述羰基还原酶的编码基因如SEQIDNO.2所示。作为优选，所述辅因子为NAD+。作为优选，所述氢供体为异丙醇。作为优选，每升生物催化反应体系中2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮的用量为50-100g。作为优选，每升生物催化反应体系中羰基还原酶的用量为3-10g。作为优选，每升生物催化反应体系中辅因子的用量为0.05-0.1g。作为优选，每升生物催化反应体系中氢供体的用量为50-100mL。作为优选，所述磷酸缓冲液的pH为6.5-7.5。作为优选，所述生物催化反应的温度为25-35℃，反应时间8-12h。本专利技术的有益效果是：本专利技术采用新型的羰基还原酶催化还原反应，具有生物催化剂使用量小、反应条件温和、反应时间短、收率高、光学纯度好等优势。与现有技术的化学法相比，经济性高、污染小，具有重要的工业应用价值。附图说明图1是本专利技术构建的重组羰基还原酶的表达质粒pET26-CM3；图2是大肠杆菌BL21(DE3)/pET26-CM3诱导表达后重组羰基还原酶的SDS-PAGE电泳图；其中M是蛋白分子量标准品，1号是破碎后上清液，2号是纯化后的重组羰基还原酶。图3是反应过程中底物和产物HPLC液相图。(A)反应0h的液相图；(B)反应6h后的液相图。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。本专利技术中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。本专利技术的工艺路线如下：实施例1：(1)羰基还原酶编码基因的合成：根据羰基还原酶CM3的原始基因序列(genebankSequenceID:ABB91667.1)，按照大肠杆菌密码子分析用表对原始基因序列进行密码子优化并进行目的基因的全合成，基因合成委托上海捷瑞生物科技有限公司进行，获得的编码基因序列如SEQIDNO.2所示，翻译后的羰基还原酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。合成后的编码基因两端分别带用NdeI和XhoI酶切位点并连接到pET26b(+)上，获得重组表达载体pET26b-CM3(见图1)。(2)羰基还原酶的表达：制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将重组表达载体pET26b-CM3通过热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中并涂布到含有50μg/mL的LB平板上(10g/L蛋白胨,0.5g/L酵母粉,10g/L氯化钠,20g/L琼脂,pH7.0)，37℃过夜培养。次日，挑取单菌落，将单菌落接入到5mL含卡那霉素的LB培养液中，37℃，振荡培养过夜，次日取1mL菌液加入到含卡那霉素的100mLTB培养基中(12g/L蛋白胨,24g/L酵母粉,4mL/L甘油,0.1M磷酸缓冲液,pH7.0)，37℃下振荡培养至OD600至3.0，然后添加IPTG至终浓度为0.1mM，25℃下诱导培养过夜。图2说明重组羰基还原酶在大肠杆菌中获得了正确表达。(3)细胞破碎：5000g离心10min后收集菌体，用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)缓冲液重悬菌体，超声破碎后所得液体即为粗酶液。(4)生物催化反应：将5g底物2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮加入到含有85mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.0)的250mL反应器中，随后，将15mL含有5mL异丙醇，10mgNAD+，500mg羰基还原酶的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)加入该反应器中。在30℃下磁力搅拌反应，并用碱调节反应的pH值，使其维持在7.0左右。利用薄层层析法定性检测底物的消耗及产物的生成情况。HPLC检测底物完全消耗(约8-10小时)，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，得油状液体，手性ee值大于99,收率为90.5％。图3说明利用该重组羰基还原酶可以催化底物生成产物，6h后产物峰明显增大，底物峰减小。(5)产物鉴定：利用核磁共振1HNMR对目标产物进行鉴定，(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇核磁数据1HNMR(400MHz,chloroform-D)δppm1.65(d,J＝6.8Hz,3H)5.58(q,J＝6.9Hz,1H)6.96-7.10(m,1H)7.22-7.36(m,1H)。实施例2：本实施例与实施例不同之处在于步骤(4)：将100g底物2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮加入到含有850mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.0)的2.5L反应器中，随后，将150mL含有100mL异丙醇，50mgNAD+，10g羰基还原酶的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)加入该反应器中。在30℃下磁力搅拌反应，并用碱调节反应的pH值，使其维持在7.0左右。利用薄层层析法定性检测底物的消耗及产物的生成情况。HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，得油状液体，手性ee值大于99，产品收率为89.5％。实施例3：本实施例与实施例不同之处在于步骤(4)：将80g底物2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮加入到含有850mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.0)的2.5L反应器中，随后，将150mL含有70mL异丙醇，80mgNAD+，3g羰基还原酶的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)加入该反应器中。在30℃下磁力搅拌反应，并用碱调节反应的pH值，使其维持在7.0左右。利用薄层层析法定性检测底物的消耗及产物的生成情况。HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，得油状液体，手性ee值大于99，产品收率为88.6％。以上所述的实施例只是本专利技术的一种较佳的方案本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用羰基还原酶制备克唑替尼中间体的方法，其特征在于，以2’,6’‑二氯‑3’‑氟苯乙酮为底物，磷酸缓冲液为反应介质，加入羰基还原酶、辅因子及氢供体形成生物催化反应体系，发生生物催化反应生成(S)‑2’,6’‑二氯‑3’‑氟苯乙醇。
【技术特征摘要】
1.一种利用羰基还原酶制备克唑替尼中间体的方法，其特征在于，以2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮为底物，磷酸缓冲液为反应介质，加入羰基还原酶、辅因子及氢供体形成生物催化反应体系，发生生物催化反应生成(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述羰基还原酶的编码基因如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述辅因子为NAD+。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述氢供体为异丙醇。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，每...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐云平，丁国芳，余方苗，杨最素，黄芳芳，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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