一种葡萄籽原花青素低聚体高效提取分离方法技术

本发明专利技术属于葡萄籽综合利用的技术领域，具体涉及一种葡萄籽原花青素低聚体高效提取分离方法。该种葡萄籽原花青素低聚体高效提取分离方法，包括以下步骤：（1）低温干燥粉碎；（2）脱脂；（3）酶处理；（4）原花青素提取；（5）低温浓缩；（6）原花青素高聚体降解；（7）纯化；（8）低温浓缩、干燥。该提取分离方法明显提高了葡萄籽原花青素的得率以及提取液中低聚体原花青素的含量，同时低温提取分离很好保留了原花青素的生物活性，通过柱层析分级纯化得到高纯度原花青素低聚体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于葡萄籽综合利用的
，具体涉及一种葡萄籽原花青素低聚体高效提取分离方法。
技术介绍
葡萄籽原花青素具有C6-C3-C6结构，是以黄烷-3-醇为基本组成单位通过C4-C8或C4-C6缩合而成的多酚类化合物，其中低聚体原花青素为n＝2～5，高聚体原花青素为n>5。原花青素生化活性表现在具有抗氧化活性和清除超氧阴离子、羟自由基等自由基的作用，具体表现为保护心血管系统、降血脂、降血糖、抗辐射等。自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。研究表明原花青素是有效的自由基清除剂，特别是低聚体原花青素对自由基和活性氧清除能力远高于其他抗氧化剂(如VE和VC)，能预防因人体血液中低密度脂蛋白氧化而引起的动脉硬化。原花青素抗氧化活性受聚合度的影响，低聚体活性高，聚合度越高抗氧化活性越低。人们随着对原花青素的深入认识和对不同聚合度原花青素生物活性的发现，开始对低聚体原花青素进行研究与分离。近年来，分离低聚体原花青素方法很多，如通过高压微滤膜技术纯化葡萄籽原花青素低聚体，效率高、工艺简单，但难以工业化生产且生产成本较高，浓缩后的高聚体原花青素容易降低微滤膜的通透性；或是通过超临界CO2萃取技术添加甲醇或乙醇等夹带剂分离葡萄籽原花青素低聚体，甲醇效果较好，萃取物中单体及二聚体含量高，但总提取率较低且一部分低聚体原花青素与高聚体仍留在葡萄籽中，造成资源浪费，利用率不高。现有技术多侧重于原花青素提取或高聚体降解工艺研究，对于低聚体的制备、分离纯化方法没有明确的表述甚至结论牵强。因此到目前为止还没有非常有效的方法能够将葡萄籽中的低聚体原花青素进行初步分离与鉴定。葡萄籽约占酿酒葡萄重量5％，是葡萄产业产生的较大量的资源性副产物，酿酒葡萄产量近100万吨，每年仅葡萄酒生产产生的葡萄籽达数万吨。葡萄籽含有丰富的多酚类物质，其中原花青素约占葡萄籽5％左右，故研究原花青素低聚体的有效分离及纯化不仅具有重要的理论价值，同时对于延长葡萄产业链、环境保护、资源有效利用也有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述存在的缺陷而提供一种葡萄籽原花青素低聚体高效提取分离方法，该提取分离方法明显提高了葡萄籽原花青素的得率以及提取液中低聚体原花青素的含量，同时低温提取分离很好保留了原花青素的生物活性，通过柱层析分级纯化得到高纯度原花青素低聚体。本专利技术的技术方案为：一种葡萄籽原花青素低聚体高效提取分离方法，包括以下步骤：(1)低温干燥粉碎：首先将葡萄籽进行低温干燥；然后粉碎得到40-60目葡萄籽粉；(2)脱脂：对所得葡萄籽粉通过超临界二氧化碳萃取葡萄籽油进行低温去除油脂，得到脱脂葡萄籽粉；(3)酶处理：采用纤维素酶、β-葡萄糖苷酶对所得脱脂葡萄籽粉进行生物酶处理：取脱脂葡萄籽粉以固液比1:20加入蒸馏水；以脱脂葡萄籽粉为底物，分别加入20U/mL纤维素酶和10U/mLβ-葡萄糖苷酶，酶解条件为：pH值4.4、酶解温度47.8℃、酶解时间为2h；(4)原花青素提取：采用体积分数为70％的乙醇对经过生物酶处理的脱脂葡萄籽粉进行提取得到原花青素提取液；提取液中原花青素平均聚合度为3～10，低聚体含量为40～60％；(5)低温浓缩：在40℃、真空度0.08Mpa的条件下对所得原花青素提取液进行浓缩，离心取上清液获得原花青素水溶液；(6)原花青素高聚体降解：采用复合酸对所得原花青素水溶液进行降解，得到原花青素低聚体混合物溶液，其中复合酸由草酸、冰乙酸和亚硫酸复配而成；(7)纯化：首先对降解后所得的原花青素低聚体混合物溶液进行大孔树脂吸附、水洗除杂；然后采用乙醇进行梯度洗脱，依次分别得到不同聚合度的低聚体原花青素乙醇溶液；(8)低温浓缩、干燥：对上述不同聚合度的低聚体原花青素乙醇溶液进行低温浓缩，获得原花青素低聚体水溶液；通过冷冻干燥得到成品。所述步骤(1)中葡萄籽在温度为30～50℃，真空度0.06Mpa～0.09MPa的条件下进行低温干燥。所述步骤(2)中超临界二氧化碳萃取的萃取压力为32.30MPa，萃取温度为41.5℃，萃取时间为75min；最终油脂得率为16.0％，残油得率0.2％～0.5％。所述步骤(3)中采用pH缓冲液NaH2PO4。所述步骤(4)提取固液比为1:10，温度为70℃，采用盐酸调节pH值为3.0，提取时间为2小时的条件下进行提取3次。所述步骤(6)降解在50℃的条件下反应30分钟，其中所述草酸浓度为20g/L；所述复合酸按照体积比草酸：冰乙酸：亚硫酸为1:1:1；所述复合酸与原花青素水溶液体积比为5:1。所述步骤(7)纯化中采用大孔树脂HPD100进行吸附，其中吸附的进样浓度为8g/L，进样速度为2bv/h，水洗速度为2bv/h，吸附2h；乙醇梯度洗脱具体为：乙醇体积分数为0-10％时，洗脱出聚合度为1.47的原花青素低聚体；乙醇体积分数为10-20％时，洗脱出聚合度为1.78的原花青素低聚体；乙醇体积分数为20-30％时，洗脱出聚合度为2.53的原花青素低聚体；乙醇体积分数为30-40％时，洗脱出聚合度为2.78的原花青素低聚体；乙醇体积分数为40-50％时，洗脱出聚合度为3.545的原花青素低聚体；乙醇体积分数为50-60％时，洗脱出聚合度为4.40的原花青素低聚体。所述步骤(1)中葡萄籽采用未发酵白葡萄籽。所述步骤(8)低温浓缩、干燥中在40℃、真空度0.09Mpa条件下进行低温浓缩；冷冻干燥条件为真空度1.1pa，预冻初始温度为-36℃，加热温度-10℃。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述葡萄籽原花青素低聚体高效提取分离方法以未发酵白葡萄籽为原料，干燥粉碎后经超临界CO2流体萃取法去除油脂，利用生物酶法处理葡萄籽粉，采用酸式溶剂法提取目标物质，提取液经酸性试剂水解获得高含量原花青素低聚体，经大孔树脂柱层析分离原花青素低聚体，干燥得样品。将溶剂提取法—酸式降解法—柱层析分级法协同结合分离提取原花青素低聚体，该工艺可大大提高提取液中原花青素特别是低聚体原花青素的含量，且在酸性条件中原花青素性质较稳定，提取液中原花青素含量同比增加10％～15％，原花青素提取液中平均聚合度降低2～3个单位。采用纤维素酶破坏细胞壁，促进葡萄籽中原花青素的溶出；采用β-葡萄糖苷酶处理葡萄籽粉不仅可以破坏植物细胞壁，也可以使得花色苷(原花青素与多糖结合)分解为游离的原花青素。纤维素酶最大限度作用于细胞壁纤维素β－1，4-葡萄糖苷键，破坏细胞壁，减小传质阻力，加速原花青素的溶出效率。β-葡萄糖苷酶在自然条件下原花青素呈游离态的极少，主要以糖苷形式存在，原花青素常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷存在。通过添加β-葡萄糖苷酶，酶解后可增加原花青素提取率。该酶是一种内切酶，专一作用β-葡聚糖的1,3及1,4-糖苷键。下面对纤维素酶与β-葡萄糖苷酶的协同配合使用过程中用量搭配进行实验测试，结果见表1。表1通过表1可以得出：增加纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的量可有效增加原花青素的溶出，当纤维素酶添加量超过20U/mL及β-葡萄糖苷酶添加量超过10U/mL，原花青素提取量不在继续增加，说明在该酶浓度范围下酶解效率最高，因此选择纤维素酶添本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄籽原花青素低聚体高效提取分离方法，包括以下步骤：（1）低温干燥粉碎：首先将葡萄籽进行低温干燥；然后粉碎得到40‑60目葡萄籽粉；（2）脱脂：对所得葡萄籽粉通过超临界二氧化碳萃取葡萄籽油进行低温去除油脂，得到脱脂葡萄籽粉；（3）酶处理：采用纤维素酶、β‑葡萄糖苷酶对所得脱脂葡萄籽粉进行生物酶处理：取脱脂葡萄籽粉以固液比1:20加入蒸馏水；以脱脂葡萄籽粉为底物，分别加入20U/mL纤维素酶和10U/mLβ‑葡萄糖苷酶，酶解条件为：pH值4.4、酶解温度47.8℃、酶解时间为2h；（4）原花青素提取：采用体积分数为70%的乙醇对经过生物酶处理的脱脂葡萄籽粉进行提取得到原花青素提取液；提取液中原花青素平均聚合度为3～10，低聚体含量为40～60%；（5）低温浓缩：在40℃、真空度0.08Mpa的条件下对所得原花青素提取液进行浓缩，离心取上清液获得原花青素水溶液；（6）原花青素高聚体降解：采用复合酸对所得原花青素水溶液进行降解，得到原花青素低聚体混合物溶液，其中复合酸由草酸、冰乙酸和亚硫酸复配而成；（7）纯化：首先对降解后所得的原花青素低聚体混合物溶液进行大孔树脂吸附、水洗除杂；然后采用乙醇进行梯度洗脱，依次分别得到不同聚合度的低聚体原花青素乙醇溶液；（8）低温浓缩、干燥：对上述不同聚合度的低聚体原花青素乙醇溶液进行低温浓缩，获得原花青素低聚体水溶液；通过冷冻干燥得到成品。...

【技术特征摘要】
1.一种葡萄籽原花青素低聚体高效提取分离方法，包括以下步骤：（1）低温干燥粉碎：首先将葡萄籽进行低温干燥；然后粉碎得到40-60目葡萄籽粉；（2）脱脂：对所得葡萄籽粉通过超临界二氧化碳萃取葡萄籽油进行低温去除油脂，得到脱脂葡萄籽粉；（3）酶处理：采用纤维素酶、β-葡萄糖苷酶对所得脱脂葡萄籽粉进行生物酶处理：取脱脂葡萄籽粉以固液比1:20加入蒸馏水；以脱脂葡萄籽粉为底物，分别加入20U/mL纤维素酶和10U/mLβ-葡萄糖苷酶，酶解条件为：pH值4.4、酶解温度47.8℃、酶解时间为2h；（4）原花青素提取：采用体积分数为70%的乙醇对经过生物酶处理的脱脂葡萄籽粉进行提取得到原花青素提取液；提取液中原花青素平均聚合度为3～10，低聚体含量为40～60%；（5）低温浓缩：在40℃、真空度0.08Mpa的条件下对所得原花青素提取液进行浓缩，离心取上清液获得原花青素水溶液；（6）原花青素高聚体降解：采用复合酸对所得原花青素水溶液进行降解，得到原花青素低聚体混合物溶液，其中复合酸由草酸、冰乙酸和亚硫酸复配而成；（7）纯化：首先对降解后所得的原花青素低聚体混合物溶液进行大孔树脂吸附、水洗除杂；然后采用乙醇进行梯度洗脱，依次分别得到不同聚合度的低聚体原花青素乙醇溶液；（8）低温浓缩、干燥：对上述不同聚合度的低聚体原花青素乙醇溶液进行低温浓缩，获得原花青素低聚体水溶液；通过冷冻干燥得到成品。2.根据权利要求1所述葡萄籽原花青素低聚体高效提取分离方法，其特征在于，所述步骤（1）中葡萄籽在温度为30～50℃，真空度0.06Mpa～0.09MPa的条件下进行低温干燥。3.根据权利要求1所述葡萄籽原花青素低聚体高效提取分离方法，其特征在于，所述步骤（2）中超临界二氧化碳萃取的萃取压力为32.30MPa，萃取温度为41.5℃，萃取时间为75min；最终油脂得率为16.0%，...

【专利技术属性】
技术研发人员：高德艳，胡文效，任继波，梁红敏，魏彦锋，汤晓宏，张晶莹，
申请(专利权)人：山东省葡萄研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37