使用可裂解探针复合检测慢性粒细胞性白血病基因的方法技术

一个具体的实施例的一种形式提供了用于检测慢性粒细胞性白血病基因表达的量的检测试剂盒，包含特异性地结合至慢性粒细胞性白血病基因的一对引物，以及可裂解探针，其特异性地结合至由该一对引物扩增的慢性粒细胞性白血病扩增产物之内。在另一个具体的实施例中，通过使用根据该一个具体的实施例的检测试剂盒测量样品中慢性粒细胞性白血病基因表达的量。当使用根据该具体的实施例的方法时，可以有效地实时检测甚至是处于低浓度下的慢性粒细胞性白血病基因表达的量，并因此在慢性粒细胞性白血病的诊断和预后方面可以是有用的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用可裂解探针复合检测慢性粒细胞性白血病基因的方法
本专利技术涉及慢性粒细胞性白血病基因诊断试剂盒和使用该试剂盒的诊断方法。更具体地，本专利技术涉及通过使用引物组和可裂解探针使得能够实时地检测基因的试剂盒，以及使用该试剂盒的诊断方法。
技术介绍
白血病泛指其中白细胞瘤性(neoplastically)增殖的所有疾病。根据白细胞起源的白细胞，白血病被分为“粒细胞性白血病(髓细胞性白血病，myelogenousleukemia)”和“淋巴性白血病(淋巴细胞性白血病，lymphaticleukemia)”，或根据进展速度，白血病被分为急性白血病和慢性白血病。根据疾病的类型和所侵袭的细胞的特征，白血病的临床类型(临床证型，clinicalpattern)不同。淋巴性白血病是由淋巴性血细胞的突变引起的，粒细胞性白血病是由粒细胞性(骨髓性，myelogenous)血细胞的突变引起的，而慢性粒细胞性白血病(CML)是由成熟细胞的突变引起的，换言之，由多能造血干细胞的恶性克隆引起的。急性粒细胞性白血病是由成髓性干细胞(myeloblasticstemcell)从血细胞生成的早期阶段开始分化的缺陷引起的。在这些不同类型的白血病中，CML是其中成髓性细胞(原始粒细胞，myeloblastcell)在骨髓中增殖并侵袭外周血或其他器官的恶性血恶液质(hematodyscrasia)，并且CML在成人中的发病率很高。诊断CML最重要的事情是通过进行染色体检验来检测费城染色体，其获得在95％或更多的患者中的阳性结果。已经查明CML的多种病因，但CML的最常见病因是染色体易位。特别是，已知9号染色体和22号染色体的易位为CML的主要病因。实践中，在约95％的CML患者中发现了9号染色体和22号染色体的相互(reciprocal)易位。该相互易位由位于9号染色体的q34区域的abl(Abelson癌基因)基因的一部分转移至位于22号染色体的q11.2区域的bcr(断裂点簇区，breakpointclusterregion)基因形成的。此重排被称为BCR-ABL重排。对于由BCR-ABL重排引起的CML，以GlivecTM的商品名市售的药物甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)具有优异的治疗效果。因此，BCR-ABL重排的早期诊断在患者治疗方案的决定和预后中非常重要。为检测BCR-ABL重排，通常使用使BCR-ABL融合基因的重组程度量化的方法。目前开展了大量研究以开发以更方便的方式使BCR-ABL融合基因的重组程度量化的方法。例如，开发了使用FISH(荧光原位杂交法)的诊断方法(Tkachuketal.,Science,250(4980):559-562,1990)、使用体细胞DNA的PCR的方法(Dobrovicetal.,Blood,72(6):2063-2065,1998)、使用RT-PRC的方法(Leeetal.,Blood,73(8):2165-2170,1989)以及使用巢式PCR(nestedPCR)的方法(Hessneretal.,Genet.Anal.Tech.Appl.,11(4):90-94,1994)。然而，以上列出的方法中，基于FISH的方法是用于直接检测其中已经发生BCR-ABL重排的单个细胞，并且因此，基于FISH的方法不允许早期检测CML。RT-PCR方法具有较高的灵敏度，但需要细胞遗传学方法，因为它通常难以设计出允许诊断患有非常罕见的CML患者的引物组。出于上述原因，在疑似患有CML的患者的情况下，在诊断的早期进行多种细胞遗传学方法。然而，细胞遗传学方法包括许多限制：只有在骨髓白细胞的细胞周期到达“中期(metaphase)”时才能进行细胞遗传学方法，需要满足各种条件如增殖细胞的提取和培养，并且需要足够的增殖细胞数量等。此外，常规的RT-PCR法是复杂的，因为根据BCR-ABL基因的类型应当进行独立的反应用于分析BCR-ABL基因。因此，通过改进传统的方法，已经研究了在诊断CML中可能是更加有用的检测方法。其结果是，开发了根据本专利技术的使用可裂解探针的检测试剂盒和使用其的诊断方法。
技术实现思路
技术问题本专利技术的一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因断裂点的试剂盒，其中，该试剂盒包含引物组和可裂解探针，其使得能够特异性地扩增BCR-ABL融合基因断裂点。本专利技术的另一个实施方式提供了诊断慢性粒细胞性白血病的方法，其中，该方法使用引物组和可裂解探针，其使得能够特异性地扩增BCR-ABL融合基因断裂点。技术方案本专利技术的一个方面提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的试剂盒，其中，该试剂盒包含至少一个引物组以及可裂解探针，其使得能够特异性地扩增BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点。本专利技术的一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的检测试剂盒，其中，该试剂盒包含：包括含有SEQIDNO:1的核酸的引物和含有SEQIDNO:2的核酸的引物的第一引物组；以及SEQIDNO:33的可裂解探针。本专利技术的另一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的检测试剂盒，其中，该试剂盒包含：包括含有SEQIDNO:3的核酸的引物和含有SEQIDNO:4的核酸的引物的第二引物组；以及SEQIDNO:33的可裂解探针。本专利技术的另一个实施方式提供了一种用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的检测试剂盒，其中，该试剂盒包含：包括含有SEQIDNO:5的核酸的引物和含有SEQIDNO:6的核酸的引物的第三引物组；以及SEQIDNO:33的可裂解探针。本专利技术的另一个实施方式提供了一种用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的检测试剂盒，其中，该试剂盒包含：包括含有SEQIDNO:7的核酸的引物和含有SEQIDNO:8的核酸的引物的第四引物组；以及SEQIDNO:33的可裂解探针。本专利技术的另一个实施方式提供了一种用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的检测试剂盒，其中，该试剂盒包含：包括含有SEQIDNO:9的核酸的引物和含有SEQIDNO:10的核酸的引物的第五引物组；以及SEQIDNO:33的可裂解探针。本文所用的术语“引物”可以与“寡核苷酸”或“多核苷酸”互换地使用。引物是指一种寡核苷酸，其在PCR中可作为DNA合成的起点。引物通常包括约15至约35个核苷酸并与靶序列的互补区杂交。本文使用的术语“探针”指的是特异性地结合至靶序列的寡核苷酸，并且包括，例如，含有特定区域的多核苷酸，该特定区域被设计为通过序列特异性的方法与特定核酸序列(如靶核酸序列)的互补区域杂交。在本专利技术的一个实施方式中，寡核苷酸探针包含约15至约60个核苷酸。适当地，寡核苷酸探针包含约18至约30个核苷酸。本文使用的术语“可裂解探针(可断裂探针，cleavableprobe)”是指包括两种类型的核酸的探针，例如，在DNA探针的内部包括一些RNA核苷酸的DNA探针。可以使用可以互补结合至共同(commonly)存在于以下中的序列的任何序列作为可裂解探针的序列：通过使用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2扩增的扩增产物、通过使用SEQIDNO:3和SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测BCR‑ABL融合基因的e19a2断裂点的试剂盒，所述试剂盒包含：选自由以下组成的组中的至少一个引物组包括含有SEQ ID NO:1的核酸的引物和含有SEQ ID NO:2的核酸的引物的第一引物组；包括含有SEQ ID NO:3的核酸的引物和含有SEQ ID NO:4的核酸的引物的第二引物组；包括含有SEQ ID NO:5的核酸的引物和含有SEQ ID NO:6的核酸的引物的第三引物组；包括含有SEQ ID NO:7的核酸的引物和含有SEQ ID NO:8的核酸的引物的第四引物组；包括含有SEQ ID NO:9的核酸的引物和含有SEQ ID NO:10的核酸的引物的第五引物组；以及SEQ ID NO:33的可裂解探针。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.01.09 KR 10-2012-00024661.一种用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的试剂盒，所述试剂盒包含：选自由以下组成的组中的至少一个引物组：包括SEQIDNO:19的核酸的引物和SEQIDNO:20的核酸的引物的第十引物组；和包括SEQIDNO:21的核酸的引物和SEQIDNO:22的核酸的引物的第十一引物组；以及SEQIDNO:33的可裂解探针，其中，所述可裂解探针在所述探针的两端标记有荧光染料化合物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的至少一个引物组，其中，所述至少一个引物组选自由以下组成的组中：包括SEQIDNO:1的核酸的引物和SEQIDNO:2的核酸的引物的第一引物组；包括SEQIDNO:3的核酸的引物和SEQIDNO:4的核酸的引物的第二引物组；包括SEQIDNO:5的核酸的引物和SEQIDNO:6的核酸的引物的第三引物组；包括SEQIDNO:7的核酸的引物和SEQIDNO:8的核酸的引物的第四引物组；和包括SEQIDNO:9的核酸的引物和SEQIDNO:10的核酸的引物的第五引物组。3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的至少一个引物组，其中，所述至少一个引物组选自由以下组成的组中：包括SEQIDNO:11的核酸的引物和SEQIDNO:12的核酸的引物的第六引物组；包括SEQIDNO:13的核酸的引物和SEQIDNO:14的核酸的引物的第七引物组；包括SEQIDNO:15的核酸的引物和SEQIDNO:16的核酸的引物的第八引物组；和包括SEQIDNO:17的核酸的引物和SEQIDNO:18的核酸的引物的第九引物组。4.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含用于检测BCR-ABL融合基因的e1a2断裂点的至少一个引物组，其中，所述至少一个引物组选自由以下组成的组中：包括SEQIDNO:23的核酸的引物和SEQIDNO:24的核酸的引物的第十二引物组；包括SEQIDNO:25的核酸的引物和SEQIDNO:26的核酸的引物的第十三引物组；包括SEQIDNO:27的核酸的引物和SEQIDNO:28的核酸的引物的第十四引物组；包括SEQIDNO:29的核酸的引物和SEQIDNO:30的核酸的引物的第十五引物组；和包括SEQIDNO:31的核酸的引物和SEQIDNO:32的核酸的引物的第十六引物组。5.一种用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的复合试剂盒，所述复合试剂盒包含：选自由以下组成的组中的至少一个引物组包括SEQIDNO:19的核酸的引物和SEQIDNO:20的核酸的引物的第十引物组；和包括SEQIDNO:21的核酸的引物和SEQIDNO:22的核酸的引物的第十一引物组；以及SEQIDNO:33的可裂解探针，其中，所述可裂解探针在所述探针的两端标记有荧光染料化合物。6.根据权利要求5所述的复合试剂盒，其中，所述复合试剂盒包括选自由以下组成的组中的至少一个引物组：包括SEQIDNO:1的核酸的引物和SEQIDNO:2的核酸的引物的第一引物组；包括SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：金桄佑，金钟源，南都铉，奇昌锡，
申请(专利权)人：社会福祉法人三星生命公益财团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR