本发明专利技术利用建立的GFP-Bcr-Abl筛选细胞系，提供了一种异土木香内酯在制备抗慢性粒细胞性白血病药物中的应用，发明专利技术人发现异土木香内酯抗CML活性是通过特异性诱导K562细胞内自噬溶酶体活性降解Bcr-Abl融合蛋白来实现的，同时发现异土木香内酯能够显著抑制慢性粒初诊患者及耐药患者中Bcr-Abl阳性干细胞克隆的形成，这为通过异土木香内酯天然小分子化合物诱导Bcr-Abl融合蛋白降解治疗耐药或复发CML患者提供了可能性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种天然小分子化合物。
技术介绍
白血病(Leukemia)是一类造血干细胞异常的恶性克隆性疾病。在我国白血病发病率逐年上升，约占总癌症发病率的5%。其中，慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenousleukemia, CML)占成人白血病的20%。大约90%以上的CML患者可检出特异性的费城染色体(Philadelphia，Ph)，即t (9 ；22) (q34 ；qll)染色体易位，9号染色体长臂的C-Abl基因移位至22号染色体上长臂断裂点集中区(BCR)产生致癌的BCR-ABL融合基因，有95%的慢性粒细胞性白血病患者被检测有此染色体易位，该融合基因编码的Bcr-Abl融合蛋白(Bcr-Abl fus1n protein)具有很强的络氨酸蛋白激酶活性，是CML发病的分子生物学基础。基于对Bcr-Abl蛋白分子结构及其络氨酸残基功能的研宄，以它作为靶标寻找治疗CML的特效药物成为相关领域研宄的重要热点。上世纪90年代，Zimmermann研宄组经过筛选发现，小分子化合物伊马替尼(Imatinib，Gleevec)能够通过竞争性抑制Bcr-Abl蛋白与ATP结合来特异阻断该融合蛋白的络氨酸激酶活性，从而抑制CML细胞增殖并促使其凋亡，2001年美国FDA批准其用于临床治疗CML。随着Imatinib临床疗效获得肯定的同时，也渐渐发现它的缺陷:Imatinib主要针对CML早期患者，中晚期患者对Imatinib完全缓解率低于30% ;部分患者可出现Imatinib耐药且比例逐年上升，主要与BCR-ABL突变或基因扩增过表达导致其对Imatinib敏感性降低有关。针对这些问题，沿着既有的思路继续开发新一代的革G向Bcr-Abl融合蛋白的络氨酸激酶抑制剂，诸如Nilotinib，Dasatinib和Ponatinib新一代抑制剂的开发和上市，这固然是解决问题的一种选择，但是鉴于既往的经验，这种选择并不能从根本上治愈CML。因为在这种策略中，只是选择性抑制Bcr-Abl的络氨酸激酶活性，而没有除去Bcr-Abl蛋白。随着细胞分子生物学知识的积累，现在通过特定的化合物诱导细胞内的某种蛋白酶活性定点清除特定蛋白已成为可能，所以，寻求可诱导Bcr-Abl融合蛋白降解的小分子化合物已成为一种优于只抑制它的活性的治疗策略。这种策略不仅可以克服Bcr-Abl当前各种点突变造成的对络氨酸激酶抑制剂的耐药性，同时它也是靶向Bcr-Abl融合蛋白治疗CML的一种新策略，是一条充满希望值得探索的新治疗途径。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出的。本专利技术利用建立的GFP-Bcr-Abl筛选细胞系，提供了一种，专利技术人发现异土木香内酯抗CML活性是通过特异性诱导K562细胞内自噬溶酶体活性来实现降解Bcr-Abl融合蛋白的，同时发现异土木香内酯能够显著抑制慢性粒初诊患者及耐药患者中Bcr-Abl阳性干细胞克隆的形成，这为通过异土木香内酯天然小分子化合物诱导Bcr-Abl融合蛋白降解治疗耐药或复发CML患者提供了可能性。本专利技术解决的技术问题包括:1、筛选出能够降解Bcr-Abl蛋白的单体化合物-异土木香内酯；2、验证异土木香内醋对Bcr-Abl蛋白的降解效应；3、异土木香内酯对CML细胞的效应；4、异土木香内酯降解Bcr-Abl的可能机制；5、异土木香内酯抗CML耐伊马替尼细胞的效应。本专利技术创造性解决其技术问题所采用的技术方案是:构建GFP-Bcr-Abl融合蛋白质粒转入K562细胞中，不同化合物处理转染的细胞，然后检查荧光强度来筛选降解GFP-Bcr-Abl的化合物，得到可能诱导Bcr-Abl蛋白降解的化合物一异土木香内酯。通过Western bloting技术检测异土木香内醋处理或未处理的K562细胞、伊马替尼耐药细胞中的Bcr-Abl，以Bcr-Abl蛋白量是否减少或消失来判断异土木香内醋对Bcr-Abl蛋白的降解效应。通过CCK-8检测异土木香内酯处理的K562细胞来判断它对细胞活力的影响；Annex-V、PI染色异土木香内酯处理的K562细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡！Westernbloting检测异土木香内醋处理的K562细胞中的调亡Maker:Caspase_3和PARPtlReal timePCR检测异土木香内酯处理不同时相Bcr-Abl的mRNA水平；蛋白酶体抑制剂(MG132)、Caspase-3抑制剂(Z-VAD)、自噬抑制剂(3_MA，CQ)，对异土木香内酯诱导Bcr-Abl蛋白降解效应的影响。磁珠分选CML患者骨髓⑶34阳性细胞，Western bloting检测异土木香内酯对CML干细胞中Bcr-Abl蛋白的降解效应；克隆形成实验检测异土木香内酯对CML患者中干细胞形成克隆能力的影响。本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果:异土木香内酯单体化合物降解Bcr-Abl蛋白具有以下特点:I)分子量较小；2)毒性较低；3)容易获取；4)可用于耐伊马替尼CML患者。【附图说明】图1为异土木香内醋(IsoA)的结构(A)，IsoA分别处理转染GFP-Vector (B)和GFP-BCR-ABL(C)的K562细胞，导致GFP-Bcr-Abl荧光信号减弱；图2为异土木香内醋下调Bcr-Abl蛋白水平:(A) 5，10 μ M异土木香内醋处理K562细胞不同时间，Western blot检测Bcr-Abl蛋白；(B，C) 10 μ M异土木香内酯处理K562R(B)和转染T315I突变BCR-ABL(C)的32D细胞，检测Bcr-Abl蛋白；图3为异土木香内酯诱导K562细胞凋亡:(A)K562细胞经异土木香内酯处理24、48小时检测生长抑制率；(B)K562细胞经异土木香内酯处理24、48小时检测细胞凋亡率；(C)Western blot检测凋亡相关蛋白水平。图4为异土木香内酯不改变Bcr-Abl的mRNA水平；图5为自噬抑制剂抑制异土木香内酯引起的Bcr-Abl蛋白的降解:蛋白酶体抑制剂⑷和caspase抑制剂⑶不能抑制异土木香内醋引起的Bcr-Abl当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
异土木香内酯在制备抗慢性粒细胞性白血病药物中的应用，其特征在于，所述异土木香内酯特异性诱导慢性粒细胞内自噬溶酶体活性，降解慢性粒发生和发展的分子‑‑Bcr‑Abl融合蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高丰厚，吴英理，韦炜，张超，卢静，刘珍，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第三人民医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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