Sf昆虫细胞宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了Sf‑公昆虫细胞宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法。试剂盒包括稀释液、洗液、显色液、终止液、一抗包被的酶标板、Sf昆虫细胞蛋白标准品和标记的二抗，一抗为哺乳动物抗Sf昆虫细胞蛋白抗体，二抗为生物素标记的抗Sf昆虫细胞蛋白抗体。本发明专利技术的试剂盒，操作简便，检测结果准确可靠，检测灵敏度高，平均检测限低至18.4ng/ml，定量限为50ng/ml。

Sf insect cell host cell protein double anti sandwich enzyme-linked immunosorbent assay kit and method

The invention discloses a protein Sf male insect cell host cell double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay kit and method. The kit comprises a dilution liquid, lotion, color liquid, liquid, anti termination coated ELISA plate, insect cell Sf protein standard and marking the two anti, anti mammalian protein anti Sf insect cell antibodies, two for anti Sf anti insect cell protein antibody biotin labeled. The reagent box of the invention has the advantages of simple operation, accurate and reliable detection result, high detection sensitivity, low average detection limit of 18.4ng/ml, and quantitative limit of 50ng/ml.

【技术实现步骤摘要】
Sf昆虫细胞宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法
本专利技术涉及生物检测领域，尤其是涉及用于检测Sf昆虫细胞(Spodopterafrugiperda)宿主细胞蛋白残留的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法。
技术介绍
宿主细胞蛋白(Hostcellprotein，HCP)既包括宿主细胞的结构蛋白，也包括宿主细胞(传代细胞)分泌的促生长因子。它不仅能引起机体的过敏反应，还有可能引起机体对蛋白质药物产生抗体。因此控制疫苗中HCP含量是保证疫苗质量的一项重要内容。1998年，WHO制定了《使用动物细胞生产生物制品规程》，其中对传代细胞的HCP残留量提出了指导性要求，即将传代细胞HCP含量降低至可接受水平。昆虫细胞/杆状病毒表达系统已经广泛应用于重组蛋白的表达和研究中，与大肠埃希菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统并称为基因工程四大表达系统。常用的昆虫细胞株有Sf9、Sf21、high5等。用昆虫细胞/杆状病毒表达系统重组的人用疫苗CERVARIX(英国GSK公司)和PROVENGE(美国Dendreon公司)已经批准上市，流感病毒、人细小病毒B19、诺瓦克病毒等人用疫苗制品正在进行临床研究。与其他表达系统的重组制品一样，昆虫细胞/杆状病毒表达系统制备的重组人用生物制品，宿主细胞蛋白是引起副作用的重要成分，需要对其残余量进行控制。目前，《中国药典》对大肠杆菌和Vero细胞等蛋白残留检测方法作了规定，还没有昆虫细胞蛋白残留检测相关专利的报道。抗体的制备过程直接影响着抗体的效价，直接影响着检测结果。由于宿主细胞蛋白为具体组成不明的蛋白混合物，开发出针对这种复杂组成的抗体更具有挑战性。一般条件下制备得到的抗体，往往偏向于某一特定蛋白，对混合蛋白的检测效果较差，稳定性不高，难以满足实际需要。开发出可有效检测混合宿主细胞蛋白的试剂，具有非常实际的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于检测Sf昆虫细胞宿主细胞蛋白残留的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种用于检测Sf昆虫细胞宿主细胞蛋白的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，包括稀释液、洗液、显色液、终止液、一抗包被的酶标板、Sf昆虫细胞蛋白标准品和标记的二抗，一抗为哺乳动物抗Sf昆虫细胞蛋白抗体，二抗为标记的哺乳动物抗Sf昆虫细胞蛋白抗体。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，哺乳动物抗Sf昆虫细胞蛋白抗体的制备方法为：首次免疫采用抗原多点免疫，注射Sf昆虫细胞蛋白；首次免疫后进行加强免疫，共进行3～5次加强免疫，最后一次加强免疫后取血。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，兔抗Sf昆虫细胞蛋白抗体的制备方法为：首次免疫采用抗原多点免疫，注射Sf昆虫细胞蛋白；首次免疫后进行加强免疫，共进行3～5次加强免疫，最后一次加强免疫后取血。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，标记二抗的为生物素，其标记方法为：1)将兔抗Sf昆虫细胞蛋白抗体溶于碳酸盐缓冲液中，调节浓度为1～10mg/ml，装入透析袋中对碳酸盐缓冲液透析过夜；2)将Biotin-NHS溶解于DMF，浓度为1～50mg/ml。按Biotin-NHS与抗体的质量比为1:10室温搅拌下混合反应；3)在反应混合液中加入1M的NH4Cl终止反应，孵育后将反应混合物装入透析袋，在PBS中透析过液。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，酶标板的处理方法为：将哺乳动物抗Sf昆虫细胞蛋白抗体用包被液稀释成10～50μg/ml后加入酶标板，每孔50～100μl，包被过夜，再用封闭液35～37℃封闭2～5小时，封存。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，Sf昆虫细胞蛋白的制备方法为：：将Sf昆虫细胞悬浮液于离心收集细胞，加入细胞裂解液振荡裂解，10000～15000rpm离心5～10min，取上层溶液，此溶液为Sf昆虫细胞蛋白。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，稀释液中，吐温-20使用浓度为0.02％～0.1％、NBS使用浓度为1％～3％，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、TE缓冲液或碳酸盐缓冲液。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，一种检测Sf昆虫细胞宿主蛋白含量的方法，包括如下步骤：1)取出豚鼠抗Sf昆虫细胞蛋白抗体包被的酶标板，加入Sf昆虫细胞蛋白抗原标准品100μl，37℃孵育1小时，弃去孔内液体，用洗液洗3遍，拍干；2)加入生物素标记的兔抗Sf昆虫细胞蛋白抗体100μl，37℃孵育1小时，弃去孔内液体，用洗液洗6遍，拍干；3)加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素100μl，37℃孵育1小时，弃去孔内液体，用洗液洗6遍，拍干；4)加入100μlTMB显色液，室温反应10min；5)加入50μl2M硫酸终止液；6)在酶标仪上测450nm下的OD值；7)根据标准曲线得到所述待检样品中Sf昆虫细胞宿主蛋白含量。作为上述方法的进一步改进，Sf昆虫细胞蛋白抗原标准品浓度为0ng/ml～2000ng/ml。作为上述方法的进一步改进，生物素标记的兔抗Sf昆虫细胞蛋白抗体浓度为0.5μg/ml～2μg/ml。作为上述方法的进一步改进，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素的浓度为0.1μg/ml～0.5μg/ml。作为上述方法的进一步改进，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素0.1μg/ml～0.5μg/ml。本专利技术的有益效果是：本专利技术的试剂盒，操作简便，检测结果准确可靠，检测灵敏度高，平均检测限低至18.4ng/ml，定量限为50ng/ml。附图说明图1是蛋白含量测定标准曲线；图2是Sf昆虫细胞蛋白抗体纯度；图3是Sf昆虫细胞蛋白SDS-PAGE(A)及其抗体Westernblot(B)分析；图4是Sf昆虫细胞蛋白双抗夹心ELISA法标准曲线；图5是Sf昆虫细胞蛋白双抗夹心ELISA法标准曲线。具体实施方式一种用于检测Sf昆虫细胞宿主细胞蛋白的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，包括稀释液、洗液、显色液、终止液、一抗包被的酶标板、Sf昆虫细胞蛋白标准品和标记的二抗，一抗为豚鼠抗Sf昆虫细胞蛋白抗体，二抗为兔抗Sf昆虫细胞蛋白抗体。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，豚鼠抗Sf昆虫细胞蛋白抗体的制备方法为：首次免疫采用弗氏完全佐剂与抗原按1:1体积比例乳化，豚鼠背部皮下多点免疫，注射Sf昆虫细胞蛋白0.5mg/只；首次免疫14天后进行加强免疫，采用弗氏不完全佐剂，其它步骤与首次免疫相同，每次加强免疫间隔时间为10天，共进行3～5次加强免疫，最后一次加强免疫的第5～7天进行心脏取血。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，兔抗Sf昆虫细胞蛋白抗体的制备方法为：首次免疫采用弗氏完全佐剂与抗原按1:1体积比例乳化，家兔背部皮下多点免疫，注射Sf昆虫细胞蛋白1mg/只；首次免疫14天后进行加强免疫，采用弗氏不完全佐剂，其它步骤与首次免疫相同，每次加强免疫间隔时间为10天，共进行3～5次加强免疫，最后一次加强免疫的第5～7天进行心脏取血。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，标记二抗的为生物素，其标记方法为：1)将兔抗Sf昆虫细胞蛋白抗体溶于碳酸盐缓冲液中，调节浓度为6mg/ml，装入透析袋中对碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜；2)将Biotin-NHS溶解于DM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测Sf昆虫细胞宿主细胞蛋白的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，包括稀释液、洗液、显色液、终止液、一抗包被的酶标板、Sf 昆虫细胞蛋白标准品和标记的二抗，其特征在于：一抗为哺乳动物抗Sf昆虫细胞蛋白抗体，二抗为标记的Sf昆虫细胞蛋白抗体。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测Sf昆虫细胞宿主细胞蛋白的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，包括稀释液、洗液、显色液、终止液、一抗包被的酶标板、Sf昆虫细胞蛋白标准品和标记的二抗，其特征在于：一抗为哺乳动物抗Sf昆虫细胞蛋白抗体，二抗为标记的Sf昆虫细胞蛋白抗体。2.根据权利要求1所述的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：哺乳动物抗Sf昆虫细胞蛋白抗体的制备方法为：首次免疫采用抗原多点免疫，注射Sf昆虫细胞蛋白；首次免疫后进行加强免疫，共进行3～5次加强免疫，最后一次加强免疫后取血。3.根据权利要求1所述的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：兔抗Sf昆虫细胞蛋白抗体的制备方法为：首次免疫抗原多点免疫，注射Sf昆虫细胞蛋白；首次免疫后进行加强免疫，共进行3～5次加强免疫，最后一次加强免疫后取血。4.根据权利要求1或3所述的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：标记二抗的为生物素。5.根据权利要求1所述的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：酶标板的处理方法为：将一抗（抗Sf昆虫细胞蛋白抗体用包被液稀释成10～50μg/ml）后加入酶标板，包被过夜，再用封闭液35~37℃封闭2~5小时，封存。6.根据权利要求1所述的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：Sf昆虫细胞蛋白的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭涛，谭远贞，马书智，许煜华，陈丽云，黄杨波，卢全占，丁东，
申请(专利权)人：广东华南联合疫苗开发院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44