载体-宿主系统技术方案

本发明专利技术涉及包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是丝状真菌细胞。本发明专利技术还涉及包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞包含重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】载体-宿主系统
本专利技术涉及载体-宿主系统、宿主细胞、用于生产载体-宿主系统的方法、用于生产感兴趣的生物化合物的方法、用于筛选编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的方法和使用宿主细胞和载体-宿主系统的方法。技术背景在原核生物质粒中，独立于宿主基因组的自主复制的环状DNA分子已经成为基础研究和生物技术研究的工具(workhouses)，所述基础研究和生物技术研究的目的是理解细胞过程或生产商业上感兴趣的产物比如酶、代谢产物等等。但是，和一些天然存在的质粒不同，细菌中构建的质粒天生是不稳定的，并且需要选择(例如营养缺陷型标记、显性生长标记或抗生素抗性标记)来以令人满意的水平保持在细胞中。因此，细胞中质粒的存在对培养基组成提出要求，或需要持续利用(昂贵的)抗生素。该特性不仅适用于原核生物，也适用于有限数目的真核生物，主要是酵母物种和少数的丝状真菌，其中迄今已经以一定程度的成功使用了自主复制的质粒。在出芽酵母Saccharomyces cerevisiae中，质粒载体含有天然存在的2 ii M质粒的复制子，或分离自染色体DNA的自主复制序列(ARS)。天然存在的质粒起始点和生物体-特异性ARS序列在一些其他酵母物种中也已经用作质粒复制子。但是， 在丝状真菌中，用来在酵母中开发自主复制的质粒载体的方法几乎没有成功，如2 y M复制子不在这些生物体中起作用的观察结果所例证的。因此，仅对丝状真菌中的复制质粒进行了有限的利用。已经显不也在其他Aspergilli,多种Penicillium物种以及Gibberella fujikuroi 和 Trichoderma reesei 中起作用的子囊菌 Aspergillus nidulans 中最常用的质粒复制子是AMAl复制子(Gems等，1991Gene.98 (I):61-7)。该复制子表示重排的染色体A.nidulans DNA片段,所述DNA片段使得携带营养缺陷型标记(如pyrG-尿喃唳)或显性标记(如amdS-N-源或bleK-腐草霉素)的质粒能够以每个染色多拷贝地复制(Fierro 等，1996Curr Genet.29(5):482-9)。但是，类似于细菌质粒，基于AMAl的载体的有丝分裂非常不稳定，并且在丰富培养基(在PyrG和amdS的情况下)上的生长或无抗生素的培养基(在131#的情况下)上的生长导致质粒从细胞快速丢失。在许多情况下，工业发酵开发出非选择性复合培养基，所述培养基不允许使用这种有丝分裂不稳定的质粒。因此，在利用丝状真菌的大多数生产系统中，表达盒通常被异位整合进宿主基因组或偶尔经靶向整合插 A (例如niaD基因座处，允许针对氯酸盐抗性选择)。缺少参与非同源末端连接(NHEJ)的哺乳动物KU70和KU80蛋白的直向同源基因的突变体最近的可用性使得高效靶向整合策略在许多丝状真菌中可用(Ninomiya `等，2004; Proc Natl Acad Sci U S A.101:12248-53)。 但是，最终的表达仍然是基因座-依赖性的，并且允许有效表达的基因座的鉴定是耗时的。因此，如果可提高工业宿主细胞中的自主复制质粒的稳定性，使得可使用非选择性、无抗生素的培养基，这将是非常有优势的。
技术实现思路
根据本专利技术，提供了包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是丝状真菌细胞。本专利技术还提供了包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中宿主细胞包含重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸。本专利技术还提供了包含本专利技术的宿主细胞的载体-宿主系统。本专利技术还提供了用于生产宿主细胞或载体-宿主系统的方法，所述方法包括:a.提供宿主细胞和载体，所述载体至少包含自主复制序列和对所述宿主细胞而言必需的基因，b.用载体和所述必需基因的破坏构建体共转化宿主细胞以使宿主细胞缺少必需基因。本专利技术还提供了:-用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括在有益于生产感兴趣的生物化合物的条件下培养本专利技术的载体-宿主系统或宿主细胞，并任选地，从培养发酵液中分离感兴趣的化合物；-用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括生产本专利技术的宿主细胞或载体-宿主系统，并在有益于生产感兴趣的生物化合物的条件下培养载体-宿主系统或宿主细胞，并任选地，从培养发酵液中分离感兴趣的化合物；-用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括:a.提供宿主细胞，所述宿主细胞缺少必需基因，所述宿主细胞包含载体，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中宿主细胞是(i)丝状真菌细胞或(ii)包含下述重组多核苷酸构建体的宿主细胞，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸，b.任选地对所述宿主细胞提供重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸，c.在有益于生产感兴趣的生物化合物的条件下培养宿主细胞，并任选地d.从培养发酵液中分离感兴趣的生物化合物；-用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括:a.提供宿主细胞，所述宿主细胞缺少必需基因，所述宿主细胞包含载体，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是根据本专利技术的方法制备的，b.任选地对所述宿主细胞提供重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸，c.在有益于生产感兴趣的生物化合物的条件下培养宿主细胞，并任选地 d.从培养发酵液中分离感兴趣的生物化合物；-用于筛选编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的方法，其包括:a.提供可能含有编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的多核苷酸文库，b.提供大量的个体宿主细胞，所述宿主细胞缺少必需基因并包含载体，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是(i)丝状真菌细胞或(ii)包含重组多核苷酸构建体的宿主细胞，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸，c.筛选用于表达感兴趣的生物化合物的转化体；-用于筛选编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的方法，其包括:a.提供可能含有编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的多核苷酸文库，b.提供大量的个体宿主细胞，所述宿主细胞缺少必需基因并包含载体，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是根据本专利技术的方法制备的，c.筛选用于表达感兴趣的生物化合物的转化体；-根据本专利技术的载体-宿主系统用于生产感兴趣的生物化合物的用途；-根据本专利技术的载体-宿主系统用于表达编码感兴趣的化合物的多核苷酸的用途；-缺少必需基因的宿主细胞用来稳定载体的用途，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列；和-宿主细胞用来稳定载体-宿主系统的用途，所述宿主细胞是根据本专利技术的方法制备的宿主细胞。附图简沭图1P.chrysogenum/E.coli 穿梭质粒 pDSM-JAK-109,其包含如源自 pAMPF21* 的 AMAl区、组成型表达的DsRed.SKL盒和腐草霉素本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是丝状真菌细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.03.11 EP 11157871.21.包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是丝状真菌细胞。2.根据权利要求1所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞包含重组多核苷酸构建体,所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸。3.其包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞包含重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸。4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。5.根据权利要求3或4所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真菌细胞，优选地是丝状真菌细胞。6.根据前述任一项权利要求所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞的同源重组(HR)效率增加，非同源重组(HR)效率降低或非同源重组/同源重组(NHR/HR)的比率降低，这优选地以诱导型方式实现。7.根据前述任一项权利要求所述的宿主细胞，其中宿主细胞对所述必需基因的缺少是诱导型的。8.根据前述任一项 权利要求所述的宿主细胞，其中所述必需基因是真菌中的必需基因。9.根据前述任一项权利要求所述的宿主细胞，其中所述必需基因是tif35或aurl基因。10.根据前述任一项权利要求所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是Aspergillus、 Chrysosporium、PeniciIlium、Rasamsonia、Talaromyces 或 Trichoderma。11.根据权利要求10所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是Aspergillusniger、 Penicillium chrysogenum 或 Rasamsonia emersonii。12.根据前述任一项权利要求所述的宿主细胞，其中所述载体含有来自除了所述宿主物种之外的物种的控制序列。13.包含根据前述任一项权利要求所述的宿主细胞的载体-宿主系统。14.用于生产宿主细胞或载体-宿主系统的方法，所述方法包括:a.提供宿主细胞和载体,所述载体至少包含自主复制序列和对所述宿主细胞而言必需的基因，b.用所述载体和所述必需基因的破坏构建体共转化所述宿主细胞，以使所述宿主细胞缺少所述必需基因。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述宿主细胞的同源重组(HR)效率增加，非同源重组(HR)效率降低或非同源重组/同源重组(NHR/HR)的比率降低，这优选地以诱导型方式实现。16.根据权利要求14或15所述的方法，其中宿主细胞对所述必需基因的缺少是诱导型的。17.根据权利要求14至16任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包含重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸。18.根据权利要求14至17任一项所述的方法，其中所述必需基因是真菌中的必需基因。19.根据权利要求14至18任一项所述的方法，其中所述必需基因是tif35或aurl基因。20.根据权利要求14至19任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是Aspergillus、 Chrysosporium、PeniciIlium、Saccharomyces、Rasamsonia、Talaromyces 或 Trichoderma。21.根据权利要求14至20任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是Aspergillus niger、Penicillium chrysogenum、Saccharomyces cerevisiae或Rasamsonia emersonii。22.根据权利要求14至21任一项所述的方法，其中所述载体含有除了所述宿主物种之外的物种的控制序列。23.用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括在有益于生产所述感兴趣的生物化合物的条件下培养权利要求13所述的载体-宿主系统或根据权利要求1至12任一项所述的宿主细胞和任选地从培养发酵液分离所述感兴趣的化合物。24.用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括根据权利要求14至23任一项所述的方法生产宿主细胞或载体-宿主系统，和在有益于生产所述感兴趣的生物化合物的条件下培养这种载体-宿主系统或宿...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁洛夫·阿利·兰斯·伯韦比格，简·安德烈斯·科尼里斯·威廉·基尔，蒂鲍特·乔斯·维恩策尔，埃里克·皮特·洛斯，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
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