一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法技术

本发明专利技术提供一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，所述方法如下：将含有脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液中，加入整合宿主因子IHF，按照常规PCR的解链、退火、延伸三个步骤，进行反复的热循环，从而将目标核酸片段扩增，所述引物与整合宿主因子IHF的摩尔比例为0.005-1。本发明专利技术方法能够特异性地、高效地扩增目标核酸序列。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及涉及一种用于以聚合酶链式反应(PCR)为基础的核酸分子扩增技术的方法，包括线性单元、多元(multiplex)以及套式(nest)PCR反应，主要涉及一种利用耐热的、与DNA双链结合的整合宿主因子(IHF)来提高PCR扩增效率的方法。
技术介绍
PCR是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段，这种方法可在生物体外进行，不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。聚合酶链式反应技术被广泛地运用在医学和生物学的实验室，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制，以及亲子鉴定等。在实际应用中,特别是用现有的PCR技术诊断传染病的时候，仍存在一些根本的问题亟需改进，如特异性、灵敏度、反应速度等问题，特别是为了使被传染性病毒在早期感染初就能被诊断出来，因此PCR的灵敏度就显得非常的重要。研究人员已经将增效剂如聚右旋糖酐(Dextran)等树状大分子引入PCR体系，这些增效剂在一定程度上可以起到增加PCR扩增效率的作用，但在实际应用过程中，有时效果却不尽如人意，甚至会抑制PCR的扩增反应。如某些高分子增效剂，在加入反应体系后，会使反应体系粘稠，难以混合均匀，甚至定量操作等问题。而且在特异性PCR产物的灵敏度增加的同时非特异性PCR产物的灵敏度也随之增加。美国专利US PATENT 5,646,019公开了“一种利于引发扩增核酸模板的制备方法”，该方法是在PCR体系里加入了耐热的单链结合蛋白(SSB，single-stranded nucleic acid binding protein)，SSB蛋白只结合单链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增，从而实现了PCR扩增的优化,但它对提高PCR扩增灵敏度的效果并不十分显著。整合宿主因子(IHF)是耐热的双链结合蛋白，是DNA结合蛋白DNABII家族的一个成员。除了维持DNA的超螺旋和压缩状态外，这些蛋白对DNA的结构也起到其它更具体的作用，例如DNA的弯曲，基因转录调控，核蛋白复合物的装配所需的位点特异性重组反应，和起始于复制原点的复制，以及通过蛋白质-RNA相互作用控制翻译起始等。IHF有两个同源亚基(IHFα和IHFβ)，是DNA序列特异性DNA结合蛋白，可以将DNA弯曲160度以上。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题，在于提供一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，该方法能够特异性地、高效地扩增目标核酸序列。本专利技术是这样实现的：一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，所述方法如下：将含有脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液中，加入整合宿主因子IHF，按照常规PCR的解链、退火、延伸三个步骤，进行反复的热循环，从而将目标核酸片段扩增。进一步地，所述引物与整合宿主因子IHF的摩尔比例为0.005-1。本专利技术具有如下优点：本专利技术可以显著地提高PCR扩增的灵敏度，在增加特异性PCR产物的灵敏度的同时非特异性PCR产物的灵敏度并不会随之增加。本专利技术方法有助于解决现有PCR和分子克隆技术所存在的效率低等问题。填补了有关利用DNA双链结合耐热的蛋白质来提高PCR扩增效率的方法和应用领域空白。【附图说明】下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的说明。图1是本专利技术实施例1的IHFβSDS-PAGE电泳检测图。图2是本专利技术实施例1的IHFβ活性电泳检测图，其以环状的双链DNA作为底物。图3是本专利技术实施例1的IHFβ活性电泳检测图，其以线性状的双链DNA作为底物。图4是本专利技术实施例1的IHFβ活性电泳检测图，其以线性状的单链DNA作为底物。图5是本专利技术实施例2的IHFβ对PCR扩增产物电泳示意图。图6是本专利技术实施例2的IHFβ对巢式PCR扩增产物电泳示意图。【具体实施方式】本专利技术涉及一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，所述方法如下：将含有脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液中，加入整合宿主因子IHF，按照常规PCR的解链、退火、延伸三个步骤，进行反复的热循环，从而将目标核酸片段扩增。所述引物与整合宿主因子IHF的摩尔比例为0.005-1。下面结合实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。实施例1：IHF的制备1、将来源于大肠杆菌的IHFα或IHFβ亚基分别插入PET22b表达载体中，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体PET22-IHFα或者pET22-IHFβ；2、将构建好的重组载体pET22-IHFα或者pET22-IHFβ转化大肠杆菌BL21，取含重组质粒的阳性菌株加入LB液体培养基中培养过夜，之后菌液按1％比例接种到50ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为0.6-0.8；加入IPTG,将菌液放入37℃摇床中诱导表达3小时，摇床转速为160rpm；3、取诱导表达后的菌液离心得到菌体，裂解，释放蛋白质。SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。结果如图1的IHF SDS-PAGE电泳检测图所示，IHF大小为10.5KD。4、IHF的纯化利用上述方法大量培养含重组质粒的阳性菌株。菌液经离心(3000×g)15min，收集大肠杆菌菌体，-70℃冷冻放置过夜。菌体悬浮在裂解缓冲液(0.1M，0.02M EDTA和0.2mg/ml蛋清溶菌酶)(pH 7.5)，30min。冰上超声裂解菌体，裂解液离心(120000×g)90min。上清液以阴离子交换柱Prep Q纯化。以25mM Tris/HCl,1mM EDTA(pH 7.5)冲洗，再以NaCl梯度洗脱。之后，以肝素亲和柱纯化，以NaCl梯度洗脱，得到纯度为95％左右的IHF蛋白原液，即IHF蛋白原液的浓度为：1.5ng/μl。经检测，本实验获得的IHFβ的DNA序列与文献报道(Bonnefoy E等，EMBO J，10(3)：687-696,，1991)一致；GenBank:LM995446.1其序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。以下所有实验过程中所用IHF蛋白原液的浓度为：1.5ng/μl。5、IHF的活性检测(环状的双链DNA作为底物)按照下表配置10μl的反应体系<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，其特征在于：所述方法如下：将含有脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液中，加入整合宿主因子IHF，按照常规PCR的解链、退火、延伸三个步骤，进行反复的热循环，从而将目标核酸片段扩增。

【技术特征摘要】
1.一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，其特征在于：
所述方法如下：将含有脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、以
及作为模板的核酸片段的反应溶液中，加入整合宿主因子IHF，按照常规
PCR的解链、...

【专利技术属性】
技术研发人员：戚智青，唐黎，张秀英，侯丹，刁勇，齐晓雪，许瑞安，马国兴，杜民，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：福建;35