细菌宿主菌株制造技术

本发明专利技术描述了一种大肠杆菌菌株，它缺乏分别编码蛋白酶ＤｅｇＰ和Ｐｒｃ的染色体ｄｅｇＰ和ｐｒｃ，并携有突变的ｓｐｒ基因，所述突变的ｓｐｒ基因编码抑制由携有ｐｒｃ突变体的菌株所显现的生长表型的蛋白。优选地，该菌株包括编码与此菌株异源的多肽的核酸以便从中生产异源多肽。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
1.专利
本专利技术涉及应用蛋白水解-缺陷性细菌宿主菌株。更具体而言，本专利技术涉及消除对异源多肽的降解作用和提高这类多肽的产量的宿主菌株。2.相关技术描述缺乏蛋白酶或缺乏控制对蛋白酶调节的基因的大肠杆菌菌株是已知的。参见例如，Beckwith and Strauch，WO88/05821 1988年8月11日提交；Chaudhury and Smith，J.Bacteriol.，160788-791(1984)；Elish等人.，J.Gen.Microbiol.，1341355-1364(1988)；Baneyx and Georgiou，“Expression ofproteolytically sensitive polypeptides in Escherichia coli，”InStability of ProteinPharmaceuticals，Vol.3Chemical and Physical Pathways of ProteinDegradation，Ahern and Manning，eds.(Plenum Press，New York，1992)，p.69-108。这其中的一些菌株已被使用，以试图高效地生产蛋白水解敏感蛋白，特别是具有潜在的医学或商业重要用途的那些蛋白。美国专利5,508,192(授予Georgiou等人)描述了多个蛋白酶-缺陷和/或热-休克蛋白-缺陷性细菌宿主的构建。此类宿主包括单一-，双重-，三重-或四重-蛋白酶-缺陷性细菌和还携带rpoH基因突变的单一-蛋白酶细菌。公开的蛋白酶-缺陷株的实例，包括删除degP，ompT，ptr3和/或prc(tsp)的那些，以及据报道在大肠杆菌中产生高滴度重组蛋白的degP rpoH株。Park等人，Biotechnol.Prog.，15164-167(1999)也报道说，缺陷两种细胞-外膜蛋白酶(degP，prc)的菌株(HM114)较另一种有更多蛋白酶缺陷的菌株生长稍微快些并产生更多的融合蛋白。他们声称，该菌株通过恒pH-补科分批培养29小时可生长至47.86g/L细胞干重。所产生的蛋白是蛋白A-β-内酰胺酶融合蛋白，比得自其亲本株KS272的β-内酰胺酶活性高30％。Prc蛋白首先由Hara等人(J.Bacteriol.，1734799-4813(1991))作为裂解周质青霉素结合蛋白3(PBP3)羧基末端的周质蛋白酶分离出来。随后，它也被鉴定为选择性地降解具有非极性C-末端的蛋白的蛋白酶，并被重新命名为Tsp(Silber等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89295-299(1992))。经证明prc基因编码一个75kDa的蛋白，该蛋白是保护细胞免受热应激和渗透性应激的联合影响所需要的(Hara等，出处同上)。业已证实，C-末端序列决定底物优选性(Keiler等人，Protein Sci.，4，1507-1515(1995))。裂解量对于底物蛋白C-末端残基或功能性基团的同一性(identity)敏感。游离-羧基的存在，在决定带有非极性C-末端序列的密切相关肽是否被Prc高效裂解方面是重要的。在广泛多种原核生物中业已鉴定了Prc同系物，所述原核生物包括数种蓝细菌(Brand等人，Plant Mol.Bio.，20481-491(1992)；Shestakov等人，J.Biol.Chem.，26919354-19359(1994))，淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)(Black等人，J.Bacteriol.，1771952-1958(1995))，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(Fleischmann等人，Science，269496-512(1995))，和杆状巴尔通体(Bartonella bacilliformis)(GenBank系列号L37094)。Prc家族蛋白中有一种结构域类似于视黄醇-结合蛋白中的一种结构域，表明有一种共同的折叠区域，它可能在这些蛋白中形成针对疏水性底物结合袋(Silber等，出处同上；Shestakov等，出处同上)。Hara等(出处同上)发现，Δprc突变体的耐热回复体包含基因外抑制物(spr)突变。他们进一步确认野生型spr基因产物是外膜组分中的脂蛋白。他们质疑野生型spr基因是否肽聚糖-水解酶(Hara等人，Microbial DrugResistance，263-72(1996))。当spr在prc-阳性背景下不具有功能时，spr突变的抑制物被鉴定为PBP7，它是另一种青霉素结合蛋白(Hara等，1996，出处同上)。Hara等(Abstract for Table Ronde Roussel Uclat no.86，Versailles，May 1997)还描述了对spr进行的克隆和Δprc突变体(在其中Spr不被蛋白酶降解)的制备，作者在文中得出结论prc和spr是交互抑制物。利用大肠杆菌的prc(tsp)无效菌株的条件致死表型，也已经分离出三种多拷贝prc抑制基因(Bass等人，J.Bacteriol.，1781154-1161(1996))。它们当中无一与spr基因相关。这些抑制基因之中的一套是在染色体上定位于72.5分钟的位置的两个串联的假定蛋白酶基因。这两个基因是htrA同系物，其编码与HtrA(DegP)丝氨酸蛋白酶分别有58％和35％的同一性的蛋白。另一种鉴定出的抑制基因是dksA(dnak抑制者)基因，其也是一个缺乏热-休克基因dank，dnaj和grpE的多拷贝抑制基因。dksA基因作为mukB突变的一个多拷贝抑制基因，也已被独立地分离出来，所述mukB突变是染色体分配所需要的。第三种类型是截短的脂蛋白A(rlpA)基因。基因degP看来控制细胞-外膜蛋白酶DegP(HtrA)的合成。degP-缺陷突变体被Beckwith和Strauch(出处同上)首先构建并重组入大肠杆菌染色体中。HtrA具有约500kDa的高分子量，它是一个热-休克蛋白，其蛋白质水解活性对于大肠杆菌在高温下如超过42℃的存活是必不可少的(Skorko-Glonek等人，Gene，16347-52(1995))。大量通常不稳定的细胞-外膜蛋白可以由degP突变来稳定(Strauch and Beckwith，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，851676-1580(1988))。最近，据报道，通过电子显微镜检查和化学交联分析发现，HtrA蛋白表现为由两组六聚体环构成的十二体(Kim等人，J.Mol.Biol.，2941363-1374(1999))。蛋白底物，通过例如暴露于高温或经历二硫键还原作用而发生的解折叠，对于它们进入双环形HtrA的内部空间是必不可少的，在所述内部空间可发生肽键裂解(Kim等，出处同上)。在各种缺陷蛋白酶的菌株中已生产了许多异源多肽。然而，其中有很多菌株的产物滴度相对低下和/或菌株生长不佳。因此需要提供一种细菌菌株，它在不引起产物修剪但提供高滴度产物的蛋白酶中有缺陷。专利技术概述因此，本专利技术就是如权利要求书所要求的那样。一方面本专利技术提供一种大肠杆菌菌株，它缺乏分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠杆菌菌株，其缺乏分别编码蛋白酶ＤｅｇＰ和Ｐｒｃ的染色体ｄｅｇＰ和ｐｒｃ，并携有突变的ｓｐｒ基因，所述突变的ｓｐｒ基因的产物抑制由携有ｐｒｃ突变体的菌株所显现的生长表型。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯蒂娜YC陈，
申请(专利权)人：杰南技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]