人血清白蛋白的纯化制造技术

本发明专利技术涉及从生产人血清白蛋白（ｈＳＡ）的宿主细胞的内源血清白蛋白中纯化ｈＳＡ的方法。该方法包括提供含ｈＳＡ及宿主细胞的血清白蛋白的样品，将样品上样到亲和柱上，该柱结合ｈＳＡ的亲和力大于其结合宿主细胞血清白蛋白的亲和力，从亲和柱上洗脱结合的ｈＳＡ，并将洗脱的ｈＳＡ结晶，本发明专利技术还涉及包含由本发明专利技术的方法生产的ｈＳＡ的组合物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
相关申请本申请要求于2001年6月13日提交的专利USSN 60/297,884的优先权。此处该专利作为参考文献引用。
技术介绍
在血液中，血清白蛋白是含量最多的蛋白质之一。血液中它们具有例如脂肪酸之类疏水分子的载体的作用，并且与有机分子结合将其隔离直至可将其清除，起到澄清剂的作用。由于它们在血液中含量丰富，血清白蛋白是决定血液性质，尤其是血清性质的主要决定因素。第二次世界大战中，人们认识到可以将hSA(人血清白蛋白)配制成生理性适用溶液来制成人类血液的代用品(人造血液)，用来补偿创伤或外科手术造成的失血。参见Cohn et al.(1946)，J.Amer.Chem.Soc.68459-75。实际上，由于人体可以迅速地补充丧失的血细胞并且不会出现血型相容性的问题，大多数情况下这种人造血液都是理想的血液替代品。此外，hSA溶液比真正的血液具有远远更长的保质期。然而由于血液中hSA的含量高，即使生产极少量的人造血液也需要高度纯化的大量hSA。转基因动物中hSA的重组生产非常吸引人，因为可以迅速从中获得大量的蛋白质，因此就有可能大批量地生产人造血液。令人遗憾的是，重组生产的hSA不能直接使用首先除了将hSA从宿主样品中存在的其他分子如脂类、小分子物质、蛋白质和病毒病原体中提纯，还必须从宿主动物的血清白蛋白中将其纯化。其次，目前从转基因动物源获得的样品中着手生产人造血液级hSA的工序即费时又昂贵。至少部分原因是适合作转基因宿主的动物中存在与之高度相似的血清白蛋白，将hSA从中分离存在相当难度。因而尽管在转基因动物中重组生产hSA具有产生大量纯净hSA和人造血液的潜力，其可行性受到经济因素的限制。专利技术概述本专利技术部分基于一种可区分人血清白蛋白(hSA)和宿主细胞血清白蛋白的分离方法的发现，宿主细胞可以是例如来自于转基因乳制品动物的转基因宿主细胞。hSA的转基因生产会形成同时含有hSA和动物内源血清白蛋白的产品。然而，通常必须获得纯化的hSA，其中不含杂质，尤其是非人类动物来源的血清白蛋白。从获自于转基因动物，比如转基因乳制品动物的样品中将hSA纯化，这个过程可能由于此类动物血清白蛋白和hSA高度的同源性而复杂化。举例来说hSA和牛血清白蛋白(BSA)非常相似。令人惊喜的是已发现使用一种方案可以适当和有效地从宿主细胞血清白蛋白中纯化转基因生产的hSA，该方案包括澄清含有hSA和内源血清白蛋白的样品，用选择性结合hSA的树脂进行亲和层析，待蛋白质从亲和柱上洗脱后将hSA结晶。因此，从一方面来看，本专利技术的特点是一种从含有hSA和宿主血清白蛋白的样品中纯化人血清白蛋白(hSA)的方法，该方法包括从宿主细胞获得含有hSA和宿主血清白蛋白的样品；上样到结合hSA的亲和柱，例如，与宿主血清白蛋白相比该柱与hSA有更强的结合亲和力；将结合的hSA从亲和柱上洗脱下来；并且将洗脱的hSA结晶。一些实施方案中样品获自于转基因非人类动物。该动物可为哺乳动物，比如有蹄类动物(如牛，山羊、或绵羊)、猪、小鼠或者兔。样品可以从例如哺乳动物的乳汁、血液或者组织(例如组织匀浆)中获得。其他实施方案中，样品从鸟类如鸡、火鸡、鸭子、野鸡或者鸵鸟中获得。举例来说，样品可以获自鸟类的卵、血液或者组织(例如组织匀浆)。优选实施方案中，所选动物为哺乳动物，且样品为乳汁。其他实施方案中，样品为培养的细胞如哺乳动物细胞、鸟类细胞、鱼类细胞或者昆虫细胞的培养基。一些实施方案中，培养的细胞为转基因细胞。举例来说，培养的细胞可包含转基因，该转基因包含在合适调控元件控制下的编码hSA的核酸序列。一些实施方案中，本专利技术方法中使用的样品为通过例如离心之类标准脱脂质程序进行脱脂的乳汁。在相关实施方案中，本专利技术方法中使用的乳汁(例如脱脂质乳汁)样品经过了除酪蛋白处理。举例来说，通过降低乳汁的pH值形成包含酪蛋白的重沉淀物可以将乳汁中酪蛋白的水平降至最低。在优选实施方案中，通过加酸将乳汁的pH值降低，例如向乳汁中加稀乙酸之类的稀酸。在优选实施方案中乳汁的pH值降至约4.2至4.8。在一些实施方案中，通过过滤除去乳汁中酪蛋白的重沉淀物，例如使用切向流微过滤法。其他实施方案中，从乳汁中通过离心除去酪蛋白的重沉淀物。在另一些其他实施方案中，不使用酸性沉淀酪蛋白，通过切向流过滤将酪蛋白从样品中除去。一些实施方案中，本专利技术方法中使用的样品可以是已除净酪蛋白的脱脂质乳汁。此处该样品称为“澄清的乳汁样品”。澄清的hSA样品可以进行亲和层析或者在此之前再进行一道或更多道纯化程序。一些实施方案中纯化的hSA样品存在于适于亲和柱上样的盐缓冲液中。例如，盐缓冲液可以包含例如pH为8.5的250mM NaCl以及低浓度的非离子去垢剂。一些实施方案中，本专利技术方法包括使用与hSA样品(例如澄清的hSA样品)中的hSA蛋白质结合的亲和柱，其中亲和柱包含合成树脂。在Prometic Biosciences Blue SA柱中发现适于结合hSA的人造树脂，该柱使用染料活性蓝2(Reactive Blue 2)的修饰体作为亲和配基。在优选实施方案中，亲和柱，例如合成树脂亲和柱，基本不和hSA样品中多数甚至大多数非hSA蛋白质结合(例如乳清蛋白质)。在特别优选的实施方案中，亲和柱，例如合成树脂亲和柱，与非人血清白蛋白的亲和力，例如牛血清白蛋白之类的哺乳动物血清白蛋白，比其与hSA的亲和力低。在相关实施方案中，本专利技术方法包括使用与hSA样品(例如澄清hSA样品)中hSA蛋白质结合的亲和柱，其中亲和柱配基和hSA间的作用可被脂肪酸分子破坏。优选的实施方案中，脂肪酸分子为辛酸盐。一些实施方案中，本专利技术方法包括将hSA样品(例如澄清hSA样品)加到柱上后对亲和柱进行清洗。优选实施方案中，清洗缓冲液与上样缓冲液相同。合适的清洗缓冲液包含例如pH为8.5的250mM NaCl以及低浓度的非离子去垢剂。一些实施方案中，本专利技术方法包括使用洗脱缓冲液将与亲和柱结合的hSA蛋白质洗脱，从而制得亲和纯化的hSA样品，其中洗脱缓冲液基本不引起与亲和柱结合的非血清白蛋白蛋白质的洗脱。使用Prometic Biosciences Blue SA柱时，合适的缓冲液可由磷酸盐缓冲液和与亲和柱上亲和配基竞争结合hSA的脂肪酸分子组成。一些实施方案中，洗脱缓冲液包含约pH为6.0的20-50mM磷酸盐溶液。一些实施方案中，洗脱缓冲液包含脂肪酸辛酸盐，如浓度约为20mM。一些实施方案中，本专利技术方法包括将亲和纯化所得hSA样品再上样到亲和柱，清洗结合hSA的亲和柱并且洗脱结合在亲和柱上的hSA，从而获得两次亲和纯化的hSA样品。在其他一些实施方案中，亲和纯化后的hSA样品可以不止一次再上样到亲和柱，例如三次纯化的hSA样品。之后亲和纯化的hSA样品可以进行结晶或者在结晶之前再进行一道或多道额外的纯化程序。一些实施方案中，本专利技术方法包括向样品中加入结晶剂将亲和纯化的hSA样品(例如通过一次或两次亲和纯化的hSA样品)结晶。许多结晶剂都可以加入hSA溶液作为结晶引发剂，其包括聚乙二醇(PEG)、硫酸铵和/或磷酸盐。优选的实施方案中，结晶剂为磷酸盐溶液。在一项优选的实施方案中，作为结晶剂的磷酸盐加入样品中至最终浓度为2.7至2.8M磷酸盐。一些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从含有人血清白蛋白（ｈＳＡ）和宿主细胞血清白蛋白的样品中纯化ｈＳＡ的方法，包括：从宿主细胞获得含有ｈＳＡ和宿主细胞血清白蛋白的样品；上样至亲和柱，该亲和柱结合ｈＳＡ的亲和力高于与宿主细胞的血清白蛋白的结合亲和力； 从亲和柱上洗脱结合的ｈＳＡ；和将洗脱下的ｈＳＡ结晶。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：S富尔顿，
申请(专利权)人：陶洛斯HSA有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]