一种重组博落回防御素功能蛋白及其制备方法与应用技术

一种重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，包括以下步骤：构建含博落回防御素功能蛋白编码基因的重组表达载体；将上述得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌；重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得博落回防御素功能蛋白。本发明专利技术采用重组菌（含有核苷酸为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所述博落回防御素功能蛋白编码基因片段的重组菌）表达得到的发酵产物抗菌活性高，将所生产的发酵液上清，直接用于体外抗菌实验，具有抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的能力，可用于制备抗菌饲料添加剂，工艺步骤简单，成本低廉，具有良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种重组博落回防御素功能蛋白及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种植物防御素的重组表达方法，尤其是涉及一种重组博落回防御素功能蛋白，以及利用酿酒酵母表达重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，以及博落回防御素的应用研究。
技术介绍
防御素是一种遍布于动植物中的阳离子抗菌肽，是生物体长期进化的自身防御体系的重要组成部分，其大小约为5kDa，含有6个或者8个保守半胱氨酸残基，能直接作用于病原菌，是生物先天免疫系统中的重要物质。根据分子结构和来源的不同，可分为五类：哺乳动物α-防御素，β-防御素，θ-防御素，昆虫防御素和植物防御素。植物防御素是一类阳离子肽，是植物内免疫系统的主要成分之一，参与了多种植物生理生化活动。植物防御素含8个保守半胱氨酸，形成4对链内二硫键来稳定其3条反向平行的β折叠片和1个α螺旋，构成所谓的Csαβ模体结构。植物防御素具有抑制真菌和细菌生长、抑制酶的活性、抑制癌细胞增殖和作为离子通道阻断剂等功能。博落回属于罂粟科草本植物，是我国传统中草药，具有抑菌杀虫的功效。由于罂粟科植物大多富含生物碱而备受关注。目前关于罂粟科植物的研究也主要集中在其生物碱，博落回的研究亦是如此。朱鹏程于2013年发表的“博落回叶片cDNA文库的构建及EST分析”([D].湖南农业大学,2013.)，公开了构建博落回叶片cDNA文库的构建以及初步的EST分析，但未报道博落回防御素的相关基因；李赛于2014年发表的《博落回叶cDNA文库表达序列标签分析和防御素重组表达》（[D].湖南农业大学,2014.），公开了对博落回防御素基因的分析以及对预测的五种防御素前体中的McDef1和McDef5的基因序列，并采用大肠杆菌原核重组表达和毕赤酵母真核重组表达，其中包含的目的蛋白片段是前体蛋白去掉信号肽，包括中间肽和成熟肽；对表达产物进行蛋白质电泳，毕赤酵母表达产物未见相应的目的蛋白，仅采用pET32表达的产物有明显的含目的基因产物的蛋白，是融合蛋白，还需进一步采用蛋白酶酶切才能产生目的蛋白分子；大肠杆菌表达和毕赤酵母表达均未表达得到有活性的重组博落回防御素功能蛋白。以上重组表达方法中，由于博落回防御素的中间肽和成熟肽之间的剪切位点尚未明确，将两者一起同时表达时，中间肽的存在可能对表达产物的活性产生了负面影响。因此，鉴于博落回防御素的优良性能和广泛的应用市场，亟需准确确定中间肽和成熟肽的分割位点，并在此基础上提供一种高效的博落回防御素功能蛋白的重组表达方法，并进一步对博落回防御素重组菌发酵工艺的优化以及发酵产物的应用研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种博落回防御素功能蛋白，以及高效表达博落回防御素功能蛋白、操作简单、易于产业化的重组博落回防御素功能蛋白的制备方法；确定采用重组菌大量表达博落回防御素的发酵工艺，以及发酵产物的应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，包括以下步骤：1）构建含博落回防御素功能蛋白编码基因的重组表达载体；2）将步骤1）得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌；3）重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得博落回防御素功能蛋白。进一步，所述博落回防御素功能蛋白编码基因，由核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示。进一步，所述博落回防御素功能蛋白，其氨基酸序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示的McDef1和/或McDef2，编码McDef1、McDef2的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示。进一步，所述博落回防御素功能蛋白的重组表达载体为酿酒酵母表达载体pVT102U/α。进一步，所述博落回防御素功能蛋白的重组菌为酿酒酵母S78。进一步，所述步骤1）中构建重组表达载体的具体操作，包括引物设计、PCR扩增、获得目的片段和构建重组表达载体。进一步，所述引物设计根据表达载体pVT102U/α上的酶切位点，上游引物设计时添加了XbaI酶切位点，在XbaI酶切位点前加有保护性碱基；下游引物设计在基因末端，并加上HindⅢ酶切位点，在HindⅢ酶切位点前加有保护性碱基，所设置的博落回McDef1和McDef2基因上游引物、下游引物分别为：博落回防御素McDef1基因上游引物：5’-CGTCTAGATAAGAGAGAAGAAATGGGACCTAAAATGGTTG-3’XbaI酶切位点，博落回防御素McDef1基因下游引物：5’-CCGAAGCTTATTCTCTTCACCTTCTCTACAT-3’HindIII酶切位点，博落回防御素McDef2基因上游引物：5’-CCGctcgagaaaagagaggctgaagctttatgtgagaaggctagccag-3’XbaI酶切位点，博落回防御素McDef2基因下游引物：5’-GCTCTAGActaacattgggagaagtagcag-3’HindIII酶切位点。进一步，所述PCR扩增：以cDNA文库中测序的相应单克隆质粒为模板，加入TaqDNA聚合酶、博落回防御素McDef1上/下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：10×TaqBuffer2.5μL，4×dNTPs2.0μL，浓度均为10pmol/μL的防御素McDef1或McDef2上/下游引物各1.0μL，模板为博落回cDNA1μL，ddH2O17μL，浓度为1U的TaqDNA聚合酶0.5μL，10×PCRBuffer包含0.5mmol/LMgCl2、50mmol/LKCl、10mmol/LTris·HCl、4×dNTPs包含用量均为2.5mmol/L的dATP、dTTP、dCTP、dGTP，反应过程依次为：a、95℃处理1min；b、依次94℃处理40s、60℃处理30s、72℃处理30s；反应过程进行25个循环；c、72℃延伸10min；即获得博落回防御素McDef1和McDef2基因编码的功能蛋白的PCR产物。进一步，所述重组表达载体：取合成的McDef1和McDef2，通过XbaI/HindIII位点克隆到酿酒酵母表达载体pVT102U/α上,得到重组表达载体pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2。进一步，所述步骤2）中构建重组菌的具体操作为：取重组表达载体pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2，热击转化酿酒酵母，采用YSD营养缺陷筛选培养基进行营养缺陷筛选，其操作为：将重组表达载体质粒DNA1.0μg；carrierDNA，10μg；上述菌悬液，20μL；PEG溶液（10×TE，1MLiAC,50%PEG4000,以1:1:8的体积比混合)1.5mL加入10mL无菌管中，混合，30℃，200rpm，培养30min；42℃热击15min后，5000g，离心5min；弃上清，细胞沉淀用200μL1×TE洗涤，5000g，离心5min；弃上清，细胞沉淀悬浮于200μL1×TE溶液中；细胞悬浮液涂YSD板，30℃培养4-6天。进一步，所述YSD营养缺陷筛选培养基，其配方如下：YNB（无氨基酵母氮源）6.7g/L，葡萄糖20g/L，亮氨酸200mg/L，腺嘌呤100mg/L，肌醇200mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核苷酸片段，其特征在于，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，用于编码博落回防御素功能蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种核苷酸片段，其特征在于，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示，用于编码博落回防御素功能蛋白。2.一种重组博落回防御素功能蛋白，其特征在于，其氨基酸序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示的McDef1和/或McDef2，编码McDef1、McDef2的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示。3.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包括如SEQIDNO.1和/或SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的酿酒酵母表达载体pVT102U/α的酿酒酵母。4.一种重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：构建含博落回防御素功能蛋白编码基因的重组表达载体；将步骤1）得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌；重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得博落回防御素功能蛋白。5.如权利要求4所述重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中构建重组表达载体的具体操作，包括引物设计、PCR扩增、获得目的片段和构建重组表达载体。6.如权利要求4所述重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中构建重组菌的具体操作为：取重组表达载体pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2，热击转化酿酒酵母，采用YSD营养缺陷筛选培养基进行营养缺陷筛选，其操作为：将重组表达载体质粒DNA1.0μg；carrierDNA，10μg；上述菌悬液，20μL；PEG溶液（10×TE，1MLiAC,50%PEG4000,以1:1:8的体积比混合)1.5mL加入10mL无菌管中，混合，30℃，200rpm，培养30min；42℃热击15min后，5000g，离心5min；弃上清，细胞沉淀用200μL1×TE洗涤，5000g，离心5m...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈金军，宋南，李骞，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43