本发明专利技术公开一种稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系及其应用，该重组细胞系是采用慢病毒载体携带目的基因构建重组质粒后转染HEK-293T细胞，产生的高滴度病毒颗粒再感染HEK-293T细胞从而构建得到的，表达稳定，在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平。由该重组细胞系制备的疫苗免疫猪能诱导动物机体产生高效价猪瘟病毒中和抗体，可抵抗猪瘟病毒强毒攻击。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及重组哺乳动物表达细胞系，具体设及一种稳定表达猪攝病毒E2蛋白 重组细胞系。本专利技术还公开了制备所述重组细胞系的方法和该重组细胞系在制备猪攝亚单 位疫苗中的应用。属于生物医药基因工程与免疫学领域。
技术介绍
猪攝（Classicalswinefever,CSFO是由猪攝病毒（Classicalswinefever virus,CSFV)引起的猪的一种急性高度致死性疾病，国际兽疫局（01巧将其定为必须通报 的疫病，我国将其列为一类动物疫病。猪攝每年给我国造成的经济损失近100亿，对我国养 猪业的危害极其严重。 目前对该病的有效预防和控制的主要措施是进行免疫。中国科学家研究成功的猪 攝弱毒疫苗（C株）对世界范围内猪攝防控发挥了卓著贡献。该疫苗目前仍被我国及世界 上多个国家使用。猪攝弱毒疫苗分为乳兔苗，免脾淋苗，原代细胞苗及传代细胞苗等。乳兔 苗和脾淋苗又称为组织苗，是采用健康家兔生产制备的。组织苗的生产需要大量动物，且工 艺复杂，成本高；原代细胞苗及传代细胞苗的生产也受到诸多因素困扰，如细胞培养用血清 中BVDV及抗体会干扰病毒生长，病毒生产滴度低、产量不稳定等。而且母源抗体干扰弱毒 疫苗的免疫效果，运也是导致猪攝疫苗免疫失败的因素之一。 CSFV为有囊膜病毒，病毒粒子大小约为40-60nm。病毒基因组为单股正链RNA，长 约12. 3化，含一个大的开放性阅读框（0RF)，编码一个大的多聚蛋白含3898个氨基酸残基， 分子量约为438kDa。多聚蛋白在翻译的同时和翻译后经病毒和宿主细胞的蛋白酶加工成 12种成熟的病毒蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白，其中结构蛋白有C、E0、E1和E2蛋白。 E2蛋白为CSFV的一种重要的囊膜糖蛋白，又称为甜55,是病毒主要的抗原蛋白。E2蛋白诱 导产生病毒的中和抗体，是猪攝病毒主要的免疫保护性抗原，也是研究猪攝基因工程疫苗 的重要祀蛋白。 鉴于现有猪攝疫苗的种种缺陷与不足，W及随着现代基因工程技术与细胞生物工 程技术的发展，许多科研人员试图W现代分子生物学手段研制出可W克服现有疫苗缺陷的 新型猪攝疫苗。运些新型的猪攝疫苗有病毒活载体疫苗、合成肤疫苗、DNA疫苗、大肠杆菌 表和昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗。 目前得到应用的有欧洲科研人员研制的W昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位 疫苗，该疫苗免疫不受母源抗体影响，而且可W与病毒感染进行抗体检测鉴别诊断，如 出ulst,etal.切totechnology, 20 (1-3) : 271-277]用 20μg昆虫细胞表达的E2 双相油包 水乳剂免疫猪，能抵抗100LD50CSFVBrescia毒株强毒的攻击，该疫苗已于上世纪九十年代 在欧洲批准上市，在欧洲国家的猪攝根除计划中发挥了重要作用。但是，该疫苗是通过昆虫 杆状病毒表达系统表达的，相对原核表达系统而言，该表达系统表达蛋白后可W在一定程 度上进行翻译后加工与修饰，但与病毒天然抗原蛋白结构仍有一定差异，蛋白表达后折叠 与修饰不如哺乳动物细胞表达系统，而且该系统生产制备抗原时，细胞经病毒感染后细胞 会裂解与死亡，对下游纯化等生产工艺增加难度。 慢病毒化entivirus)载体是WHIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来 的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够稳定表达猪攝病毒E2蛋白， 且克服了表达猪攝病毒E2蛋白对细胞毒性作用的重组细胞系。 本专利技术的另一个目的是提供上述重组细胞系在制备预防猪攝病毒疫苗药物中的 应用。 本专利技术的另一个目的是提供由上述重组细胞系和佐剂制备的猪攝亚单位疫苗。 本专利技术的另一个目的是提供上述猪攝亚单位疫苗的制备方法。 本专利技术的上述目的是通过如下方案予W实现的： 一种稳定表达猪攝病毒E2蛋白的重组细胞系，该重组细胞系是由如下方案制备 而得：步骤 1: 构建慢病毒重组载体，该慢病毒重组载体包括其中插入编码猪攝病毒E2蛋白的 基因的序列和组氨酸标签序列，所述编码猪攝病毒E2蛋白的基因的序列如SEQIDNO. 1所 示；[001引 步骤2: 将所述慢病毒重组载体与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚胎肾细胞肥K-293T，进 行病毒包装和生产，收集病毒液；[001引 步骤3: 用上述病毒液感染人胚胎肾细胞肥K-293T后培养，将培养的细胞进行稀释克隆， 收集克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较猪攝病毒E2蛋白表达量，获得稳定表达猪攝 病毒E2蛋白的重组细胞系。 上述编码猪攝病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。 本专利技术采用SDS-PAGE电泳检测重组细胞系的蛋白表达水平，结果标明筛选出的 重组细胞系在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平，证明本专利技术构建的重组细胞系能稳 定表达目的基因一猪攝病毒E2蛋白。 本专利技术还提供上述重组细胞系在制备预防猪攝病毒疫苗药物中的应用。 本专利技术还提供一种猪攝亚单位疫苗，该疫苗是由有效剂量的本专利技术所述重组细胞 系和佐剂组成。 本专利技术还提供一种猪攝亚单位疫苗的制备方法，具体包括如下步骤：[00幼步骤1: 将本专利技术所述的重组细胞系正常传代后长至融合度达到90%W上时，换无血清培 养基继续培养7d;收集培养上清经2000rpm离屯、lOmin，吸取上清液，该上清液即为疫苗抗 原液；步骤 2: 将步骤1制备的疫苗抗原液与佐剂按1 :1~1 :3重量比进行混合并充分乳化后， 则制备得到所需猪攝亚单位疫苗。 上述猪攝亚单位疫苗为双相油佐剂疫苗，所述佐剂为矿物油佐剂。 本专利技术制备的稳定表达猪攝病毒E2蛋白的重组细胞系，具有容易培养、增殖快 速、可无限扩大、性质稳定和蛋白表达量高的特点，其表达蛋白与佐剂制备成疫苗后免疫猪 能诱导动物机体产生高效价猪攝病毒中和抗体，可抵抗猪攝病毒强毒攻击。 与现有技术相比，本专利技术具有W下有益效果： 1、现有技术中采用质粒转染细胞后克隆筛选最终获得的细胞系，其重组基因表达 不稳定，不易获得高水平细胞株；而本专利技术采用慢病毒载体携带目的基因构建重组质粒后 转染肥K-293T细胞，产生的高滴度病毒颗粒再感染肥K-293T细胞从而构建得到的重组细 胞系，表达稳定，在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平； 2、本专利技术所选用的表达系统为肥K-293T细胞，得到的重组细胞系肥K-293T-E2具 有与亲本细胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的规模生产；表达蛋白在表达细胞内能得 到接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好；重组细胞可W用转瓶高密度发酵培养， 易于大量生产； 3、本专利技术构建的慢病毒重组载体中，除了包含插入编码猪攝病毒E2蛋白的基因 的序列外，还含有组氨酸标签序列，有利于后期纯化； 4、本专利技术的重组表达细胞系可W利用无血清培养基或低血清培养基进行培养表 达，可W降低疫苗生产成本； 5、将本专利技术的表达猪攝病毒E2蛋白的重组细胞培养物制备疫苗可W诱导动物机 体产生针对CSFV的高效价抗体，阻止病毒感染动物机体； 6、本专利技术抗原表达量高，利用普通细胞培养瓶皿培养，产量可达200毫克每升； 7、利用本专利技术的重组表达细胞系细胞培养物制备的油佐剂疫苗能诱导动物机体 产生高效价抗体，抗体持续时间长，能对免疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，该重组细胞系是由如下方案制备而得： 步骤1： 构建慢病毒重组载体，该慢病毒重组载体包括其中插入编码猪瘟病毒E2蛋白的基因序列和组氨酸标签序列，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的基因的序列如SEQ ID NO.1所示； 步骤2： 将所述慢病毒重组载体与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚胎肾细胞HEK‑293T，进行病毒包装和生产，收集病毒液； 步骤3： 用上述病毒液感染人胚胎肾细胞HEK‑293T后培养，将培养的细胞进行稀释克隆，收集克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较猪瘟病毒E2蛋白表达量，获得稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李安迪，高永新，李红卫，颜仁和，王升尧，
申请(专利权)人：广州伯尼兹生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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