本发明专利技术公开了一种Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白，是由人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域、人内皮抑素以及来自纤维细胞附着域的RGD三肽构成。本发明专利技术还公开了该Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白的制备方法，以及在制备治疗由新生血管生成引起的疾病的治疗药物中的应用和在制备抑制内皮细胞迁移的药物中的应用。本发明专利技术的Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白保留了内皮抑素抑制新生血管增生的活性，能够穿过血脑屏障或眼球屏障与新生血管处过表达的整合素特异性结合，融合蛋白的靶向性和停留时间得到了极大的提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种化tPTD-Endostatin-RGD重组蛋白及其制备方法与应用，属于生 物药物
技术介绍
内皮抑素巧ndostatin，Es)是0'Reilly等人1997年从血管内皮瘤中分离出来 的一种内源性血管生成抑制剂。内皮抑素是胶原蛋白XVIII分子C末端的片段，共有184 个氨基酸残基，分子量为20kDa。研究证明内皮抑素只能抑制新生血管的生成而不对已存 在的血管发生作用。内皮抑素是目前作用最强、实验效果最好的肿瘤血管生成抑制剂，近年 来倍受关注，目前在美国已经进行I期和II期临床试验，在我国已将血管内皮抑素衍生物 研制成具有国家自主知识产权的一类新药化dostaH恩度），用W治疗非小细胞肺癌。但 是，内皮抑素仍旧存在一些缺点，例如其入胞能力差、稳定性差、半衰期短等，限制了其在临 床上的应用。 申请人在前期的研究中已经成功开发了一种化tPTD-Es重组蛋白，其中，TatPTD 是人类免疫缺陷病毒HIV-I的反式激活因子的转导域，其氨基酸序列为YGRKKRRQRRR，研究 表明将其与Es通过基因工程的方法重组表达出来的蛋白质可W穿透眼球屏障到达眼底， 增加了Es的入胞能力（专利"一种化tPTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用"， 专利申请号2012101492019)。但申请人在继续研究的过程中发现，重组蛋白化tPTD-Es对 眼底视网膜内皮细胞的勒!向性和停留时间仍有待进一步的提局。 整合素为细胞黏附因子家族的重要成员之一，主要介导细胞与细胞、细胞与细胞 外基质巧CM)之间的相互粘附，并介导细胞与ECM之间的双向信号传导。整合素是由a和 0两个亚单位形成的异二聚体，表达于血管内皮细胞的有腔面和无腔面，介导内皮细胞的 迁移和毛细血管腔的形成，其中QyP3和aV0 5整合素的作用尤为重要。正常情况下，在静 息期血管内皮细胞表面a 整合素有低水平表达，在细胞因子和生长因子的刺激下，其 表达上升。研究表明，整合素在新生血管内皮细胞中有高表达，对新生血管的生成起着重要 作用，其中，其中QyPs尤为重要。因此，整合素aV03会成为一些抗血管生成药物的作用 祀点。含有精氨酸-甘氨酸-天冬酷胺序列的多肤RGD可W特异性识别整合素RGD 存在于多种细胞外基质中，可W与11种整合素特异性结合，能有效促进对细胞的附着。 但由于将不同活性的目的蛋白组合在一起进行融合表达尚存在一系列技术上的 难点，例如不同蛋白整合后是否还能具有原有的活性，融合蛋白表达体系的选择等，因此， 目前还没有关于将化tPTD、化dostatin和RGDS者进行融合表达的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种化tPTD-Endostatin-RGD重组蛋白 及其制备方法与应用。利用化tPTD的穿膜作用、Es的抑制新生血管生成的作用W及RGD =肤能够与整合素特异性结合的特性，将=者通过基因工程的方法融合表达，获得了一种 能够穿过血脑屏障或者眼球屏障的并能在新生血管表面发挥药效的内皮抑素，达到通过局 部滴眼的给药方式预防眼底新生血管疾病的目的。 为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案： -种化tPTD-Endostatin-RGD重组蛋白，其所具有的氨基酸序列如下： 上述化tPTD-Endostatin-RGD重组蛋白是由人类免疫缺陷病毒的反式激活转导 蛋白Tat的蛋白转导域、人内皮抑素W及来自纤维细胞附着域的RGD=肤构成。其中，人类 免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域的氨基酸残基序列如SEQIDNO. 2所 示，人内皮抑素氨基酸残基序列如SEQIDNO. 3所示，RGDS肤的氨基酸残基序列如SEQID NO. 4所示。 本专利技术还提供了能够分别编码上述人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白化t 的蛋白转导域、人内皮抑素W及来自纤维细胞附着域的RGD=肤的核巧酸序列，其分别具 有如SEQIDNO. 5、SEQIDNO. 6和SEQIDNO. 7所示的序列或编码相同蛋白质的与其具有 遗传密码简并性的序列。 对于编码上述人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域、人内皮 抑素W及来自纤维细胞附着域的RGD=肤的核巧酸序列，申请人在试验过程中设计了多组 核巧酸序列，但在PCR扩增过程中，发现并非所有的核巧酸序列都能进行基因的表达，经优 化筛选，得到如SEQIDNO. 5、SEQIDNO. 6和SEQIDNO. 7所示的核巧酸序列。 本专利技术还提供了化tPTD-Endostatin-RGD重组蛋白的制备方法，步骤如下： (1)融合基因的构建：采用常规方法制备含有编码化tPTD-Endostatin的目的基 因和编码二肤RGD的目的基因的化t-Endostatin-RGD融合基因，并扩增； (2)采用限制性内切酶BamHI、化OI分别酶切质粒祀T28a，并回收酶切产物，采 用Gibsonassembly的方法连接酶切质粒和化1：-6]1(1〇31曰1:;[]1-1?60融合基因；[001引做将步骤似的连接产物转化入大肠杆菌D册a感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒祀T28a/TatPTD-Endostatin-RGD,并获得最终重组表达 质粒祀T28a/TatPTD-Endostatin-RGD; (4)采用热激法将表达质粒转化入大肠杆菌化igami2 (DE3)感受态细胞中，在含 有卡那霉素、链霉素和四环素的LB平板上培养16h，筛选转化子单菌落并抽提质粒进行PCR验证，获得阳性转化子；[001引 妨将上述阳性转化子发酵，分离纯化得到发酵产物，鉴定发酵产物即为化t PTD-Endostatin-RGD重组蛋白。 步骤（2)中，Gibson assembly的方法连接酶切质粒和化1：-6]1(1〇31曰1:;[]1-1?60融合 基因的反应体系中包含有S种酶，分别为巧外切酶，化USion DNA聚合酶和化qDNA连接 酶。 所述步骤妨具体如下： ①挑选阳性转化子，过夜培养后，按1:75(体积比）接种于LB培养基中，震荡培 养至ODe。。为0. 6-0. 8,加入异丙基-0 -D-硫代化喃半乳糖巧（IPTG)，37°C，200r/min，诱导 6h，收菌； ②将菌体破壁，采用SDS-PAGE对目的蛋白进行鉴定； ③包涵体复性：菌体超声后离屯、得到包涵体，采用稀释复性或透析复性或超滤复 性法对包涵体进行复性； ④分离纯化化tPTD-Endostatin-RGD融合蛋白：将复性成功的蛋白质经亲和层 析或者离子交换层析进行纯化，除盐后得到化tPTD-Endostatin-RGD重组蛋白。所述③中，复性方法具体如下：菌体破壁后，12000r/min离屯、30min，弃去上清得 到包涵体；采用含去污剂的尿素或盐酸脈溶液洗涂多次去除粘附的杂蛋白；采用变性液对 包涵体进行溶解，在室溫揽拌化后，12000r/min离屯、即获得包涵体溶液；然后将包涵体溶 解的、变形的无生物活性的蛋白质复性，使其能够折叠成可溶的、有生物活性的构象。 所述去污剂溶液为浓度不大于2mol/L的尿素或不大于1. 5mol/L的盐酸脈，去污 剂溶液中含有hitonX-IOO和T本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Tat PTD‑Endostatin‑RGD重组蛋白，其特征在于，其所具有的氨基酸序列如下：YGRKKRRQRRRHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASKCRGDC。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王凤山，李妍，生举正，冯丹阳，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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