重组内源表达rhIL‑12的制作工艺制造技术

一种内源表达重组人白细胞介素‑12的制作工艺，该工艺的步骤包括（A）样品预处理；（B）超滤浓缩换液；（C）阳离子柱层析；（D）硫酸铵分级分离；（E）疏水柱层析；（F）阴离子柱层析；（G）凝胶过滤等步骤，采用本工艺纯化的rhIL‑12有着更高的回收率及纯度。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一种重组蛋白的制备领域，具体公开了一种重组内源表达rhIL-12的制作工艺。
技术介绍
：白细胞介素(interleukin,IL)是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名，现仍一直沿用。最初是指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子。现在是指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。白细胞介素-12(以下简称IL-12),由抗原提呈细胞和B细胞产生，是一种异源二聚体形式的前炎症细胞因子，并以这种形式分泌到细胞外。IL-12能诱导IFN-γ产生，在体内免疫应答中(特别是在细菌或寄生虫感染中)它也是IFN-γ产生所必需。主要由b细胞和巨噬细胞产生；其分子是一种异型二聚体，40kd(p40)和35kd(p35)两个亚基通过二硫键相连接。近年来，人们对IL-12的生物学途径和临床治疗的应用前景有了新的认识，但是人源重组白细胞介素12的制作工艺一直没有得到突破，阻碍了rhIL-12科研成果向产业的转化。《重组人白细胞介素-12(CHO细胞)的纯化及其活性》一文中，记载了一种重组人白细胞介素-12的纯化方法，其纯度较高，已达到99％，但是总回收率为56.4％，有一定的改进空间。有鉴于此，提出本专利技术。
技术实现思路
：本专利技术是针对rhIL-12的生物理化特性设计的完整的制作工艺，其中对关键步骤的特殊调整保证了最终产品的得率，去除培养过程中由目的蛋白降解产生的难分离型杂蛋白，提高纯度，并缩短生产周期，降低生产成本。本专利技术提供一种内源表达重组人白细胞介素-12的制作工艺，该工艺的步骤包括(A)样品预处理：将细胞培养液以0.45μm微孔滤膜过滤去除杂质；(B)超滤浓缩换液：Millipore系统超滤截留30kD蛋白；(C)阳离子柱层析：采用SPSepharoseHighPerformance分离介质；(D)硫酸铵分级分离；(E)疏水柱层析：采用PhenylSepharoseHighperformance分离介质；(F)阴离子柱层析：采用SOURCE30Q分离介质；(G)凝胶过滤：采用SephacrylS-100HighResolution分离介质，其特征在于：在样品预处理前，加入EDTA至终浓度3-5mM，调节pH值至5.0-5.5之间。优选的，(B)步骤为葡聚糖凝胶G-25脱盐柱脱盐。用pH7.0，含0.15MNaCl的50mM磷酸盐缓冲液，平衡5个柱体积。上样，洗脱。优选的，超滤浓缩换液过程中，以20mM磷酸盐缓冲液(pH＝6.5)对浓缩液进行倍比稀释，继续超滤浓缩，待体积减小后再次进行倍比稀释，按此方法共稀释4次，收集超滤浓缩液。优选的，阳离子柱层析的流动相为：A.20mM磷酸盐缓冲液(pH＝6.5)；B.20mM磷酸盐缓冲液(pH＝6.5),20％无水乙醇；C.20mM磷酸盐缓冲液(pH＝6.8)，1MNaCl；操作步骤为：以缓冲液A平衡色谱柱2～3个柱体积，线性流速75-120cm/h，待色谱柱平衡充分后，上样，线性流速75-120cm/h(柱压＜0.3MPa)，上样结束后：a.以A液流洗色谱柱2个柱体积；b.以B液流洗色谱柱3个柱体积后，再以A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线；c.以25％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；d.以65％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；e.以100％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳。优选的，硫酸铵分级分离步骤中，目的蛋白样本中加入2倍体积的3M(NH4)2SO4，立即混匀，4℃静置30分钟，待其充分沉淀后，12000rpm离心30min，去沉淀，上清备用。优选的，疏水柱层析的流动相为：A.20mMTris-Cl(pH＝8.0)，1.5M(NH4)2SO4；B.20mMTris-Cl(pH＝8.0)；操作步骤为：以缓冲液A平衡色谱柱2～3个柱体积，线性流速75-120cm/h，待色谱柱平衡充分后，上样，线性流速75-120cm/h(柱压＜0.3MPa)，上样结束后：a.以A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；b.以40％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；c.以70％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；d.以100％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳。优选的，阴离子柱层析的流动相为：A.20mMTris-Cl(pH＝8.0)；B.20mMTris-Cl(pH＝8.0)，1MNaCl；操作步骤为：样品预处理：对疏水层析所获得的目的蛋白收集峰以缓冲液A进行10倍稀释备用，色谱条件：缓冲液A平衡色谱柱2～3个柱体积，线性流速75-120cm/h，待色谱柱平衡充分后，上样，线性流速90-120cm/h(柱压＜0.3MPa)，上样结束后：a.以A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；b.以10％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；c.以28％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；d.以100％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳。优选的，凝胶过滤的流动相为：120mMNaCl，20mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)；操作步骤为：先以200mL0.2MNaOH流洗凝胶柱，然后以上述流动相对凝胶柱平衡2～2.5个柱体积，上样(单次上样量控制在柱体积的5％以内)，上样结束后继续以缓冲体系进行流洗，分别收集色谱峰。主峰可用于HPLC纯度检测，整个过程流速控制在线性流速18-21cm/h。优选的，重组人白细胞介素-12的宿主细胞为CHO细胞。优选的，表达载体选用pcDNA3.1(+)质粒。质粒图谱见图1。优选的，p35表达单元的结构为如下：SV40增强子-CMV启动子-可以增加表达效率的内含子片段-p35cDNA，p40表达单元的结构为如下核苷酸序列：SV40增强子-CMV启动子-p40cDNA。本专利技术所获得的技术效果：采用本专利技术的工艺纯化rhIL-12，尤其是CHO工程菌发酵的rhIL-12，回收率要比采用现有技术纯化有着显著提高，同时，纯化后的蛋白纯度也比现有技术方法纯化的rhIL-12纯度更高。附图说明：图1为pcDNA3.1(+)质粒图谱。图2为实施例1中阳离子柱层析色谱图。图3为实施例1中疏水柱层析色谱图。图4为实施例1中阴离子柱层析色谱图。图5为实施例1中凝胶过滤色谱图。图6为实施例1非还原SDS-PAGE电泳图。图7为实施例2中阳离子柱层析色谱图。图8为实施例2中疏水柱层析色谱图。图9为实施例2中阴离子柱层析色谱图。图10为实施例2中凝胶过滤色谱图。具体实施方式：实验例1在阳离子柱层析步骤中，前人曾用：流动相A，20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)；流动相B，采用20mmol/L磷酸盐本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种内源表达重组人白细胞介素‑12的制作工艺，该工艺的步骤包括（A）样品预处理：细胞培养上清以0.45μm 微孔滤膜过滤去除杂质；（B）超滤浓缩换液：Millipore系统超滤截留30kD蛋白；（C）阳离子柱层析：采用SP Sepharose High Performance 分离介质；（D）硫酸铵分级分离；（E）疏水柱层析：采用Phenyl Sepharose High performance分离介质；（F）阴离子柱层析：采用SOURCE 30Q分离介质；（G）凝胶过滤：采用Sephacryl S‑100 High Resolution分离介质，其特征在于：在样品预处理前，加入EDTA至终浓度3‑5 mM，调节pH值至5.0‑5.5之间。

【技术特征摘要】
2015.10.15 CN 20151066242721.一种内源表达重组人白细胞介素-12的制作工艺，该工艺的步骤包括（A）样品预处理：细胞培养上清以0.45μm微孔滤膜过滤去除杂质；（B）超滤浓缩换液：Millipore系统超滤截留30kD蛋白；（C）阳离子柱层析：采用SPSepharoseHighPerformance分离介质；（D）硫酸铵分级分离；（E）疏水柱层析：采用PhenylSepharoseHighperformance分离介质；（F）阴离子柱层析：采用SOURCE30Q分离介质；（G）凝胶过滤：采用SephacrylS-100HighResolution分离介质，其特征在于：在样品预处理前，加入EDTA至终浓度3-5mM，调节pH值至5.0-5.5之间。2.根据权利要求1所述的制作工艺，其特征在于：（B）步骤为葡聚糖凝胶G-25脱盐柱脱盐，用pH7.0，含0.15MNaCl的50mM磷酸盐缓冲液，平衡5个柱体积，上样，洗脱。3.根据权利要求1所述的制作工艺，其特征在于：超滤浓缩换液过程中，以20mM磷酸盐缓冲液（pH＝6.5）对浓缩液进行倍比稀释，继续超滤浓缩，待体积减小后再次进行倍比稀释，按此方法共稀释4次，收集超滤浓缩液。4.根据权利要求1所述的制作工艺，其特征在于：阳离子柱层析的流动相为：A.20mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.5；B.20mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.5，20%无水乙醇；C.20mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.8，1MNaCl；操作步骤为：以缓冲液A平衡色谱柱2～3个柱体积，线性流速75-120cm/h，待色谱柱平衡充分后，上样，线性流速75-120cm/h，上样结束后：a.以A液流洗色谱柱2个柱体积；b.以B液流洗色谱柱3个柱体积后，再以A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线；c.以25％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；d.以65％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；e.以100％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳。5.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘杰森，倪彦艳，刘璐瑜，陈松彬，李宇腾，
申请(专利权)人：广东科玮生物技术股份有限公司，广东思峰生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东;44