白介素‑10免疫缀合物制造技术

本发明专利技术一般涉及抗体和白介素‑10(IL‑10)的融合蛋白。更特别地，本发明专利技术关注展现改良特性的抗体和突变型IL‑10的融合蛋白，其用作治疗剂，例如在炎性疾病的治疗中。另外，本发明专利技术涉及编码此类融合蛋白的多核苷酸，和包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明专利技术进一步涉及用于生成本发明专利技术融合蛋白的方法，以及在疾病治疗中使用它们的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术一般涉及抗体和白介素-10(IL-10)的融合蛋白。更特别地，本专利技术关注展现改良特性的抗体和突变型IL-10的融合蛋白，其用作治疗剂，例如在炎性疾病的治疗中。另外，本专利技术涉及编码此类融合蛋白的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本专利技术进一步涉及用于生成本专利技术融合蛋白的方法，以及在疾病治疗中使用它们的方法。专利技术背景IL-10的生物学功能IL-10是一种α-螺旋细胞因子，作为约37kDa的非共价连接的同二聚体表达。它在耐受诱导和维持中发挥关键作用。已经有很长时间知道它的支配性抗炎特性。IL-10阻抑促炎性细胞因子的分泌，像TNFα、IL-1、IL-6、IL-12，以及Th1细胞因子，诸如IL-2和INFγ，并控制巨噬细胞、B细胞和T细胞的分化和增殖(Glocker,E.O.et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.1246,102-107(2011)；Moore,K.W.et al.,Annu.Rev.Immunol.19,683-765(2001)；de Waal Malefyt,R.et al.,J.Exp.Med.174,915-924(1991)；Williams,L.M.et al.,Immunology 113,281-292(2004))。此外，它是抗原呈递的有力抑制剂，抑制MHC II表达以及共刺激分子CD80和CD86上调(Mosser,D.M.&Yhang,X.,Immunological Reviews 226,205-218(2008))。不过，还已经报告了免疫刺激特性。IL-10能共刺激B细胞激活、延长B细胞存活、及帮助B细胞中的类别转换。此外，它能共刺激天然杀伤(NK)细胞增殖和细胞因子生成且起生长因子的作用刺激某些CD8+T细胞子集增殖(Mosser,D.M.&Yhang,X.,Immunological Reviews 226,205-218(2008)；Cai,G.et al.,Eur.J.Immunol.29,2658-2665(1999)；Santin,A.D.et al.,J.Virol.74,4729-4737(2000)；Rowbottom,A.W.et al.,Immunology 98,80-89(1999)；Groux,H.et al.,J.Immunol.160,3188-3193(1998))。重要的是，高剂量的IL-10(分别为20和25μg/kg)在人中能引起INFγ生成升高(Lauw,F.N.et al.,J.Immunol.165,2783-2789(2000)；Tilg,H.et al.,Gut 50,191-195(2002))。IL-10的免疫刺激活性据报告是由细胞IL-10中第87位处的单一氨基酸异亮氨酸决定的(Ding,Y.et al.,J.Exp.Med.191(2),213-223(2000))。IL-10经由两受体复合物发信号，该两受体复合物由IL-10受体1(IL-10R1)和IL-10R2各两拷贝组成。IL-10R1以相对较高亲和力(约35-200pM)结合IL-10(Moore,K.W.et al.,Annu.Rev.Immunol.19,683-765(2001))，而且IL-10R2募集至受体复合物对配体结合只有边缘性贡献。然而，这第二种受体衔接至复合物使得配体结合后能够发生信号转导。如此，功能性受体由IL-10R1和IL-10R2异二聚体的二聚体组成。大多数造血细胞组成性表达低水平的IL-10R1，而且受体表达常常能通过多种刺激而显著上调。非造血细胞(诸如成纤维细胞和上皮细胞)也能通过上调IL-10R1来响应刺激。相反，IL-10R2在大多数细胞上表达。IL-10对受体复合物的结合激活Janus酪氨酸激酶、JAK1和Tyk2，它们分别与IL-10R1和IL-10R2相关联，磷酸化受体的胞质尾。这导致STAT3募集至IL-10R1。STAT3的同二聚化导致它自受体释放及磷酸化STAT同二聚体移位入核，在那里它结合多种基因的启动子中的STAT3结合元件。这些基因之一是IL-10自身，它受到STAT3的正面调节。STAT3还激活细胞因子信号传导3(SOCS3)的抑制基因，SOCS3控制STAT激活的质量和数量。SOCS3受IL-10诱导，而且对多种细胞因子基因发挥负面调节效果(Mosser,D.M.&Yhang,X.,Immunological Reviews 226,205.218(2008))。遗传连锁分析和候选基因测序揭示了IL-10R1和IL-10R2中的突变和早期发作小肠结肠炎(炎性肠病(IBD)的一种形式)之间的直接联系(Glocker,E.O.et al.,N.Engl.J.Med.361(21),2033-2045(2009))。最近的数据提示早期发作IBD甚至可能是单基因的。IL-10细胞因子或其受体中的突变导致IL-10功能丧失并在婴幼儿和低龄儿童中引起严重小肠结肠炎(Glocker,E.O.et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.1246,102-107(2011))。而且，具有严重形式的克罗恩氏病的患者在全血细胞培养物和单核细胞衍生树突细胞中具有缺陷的IL-10生成(Correa,I.et al.,J.Leukoc.Biol.85(5),896-903(2009))。IBD在美国影响约140万人，在欧洲影响约220万人(Carter,M.J.et al.,Gut 53(Suppl.5),V1-V16(2004)；Engel,M.A.&Neurath,M.F.,J.Gastroenterol.45,571-583(2010))。使用IL-10的治疗办法已经对健康志愿者以及特定患者群体在多种设置中在调查静脉内或皮下施用的单剂或多剂的安全性、耐受、药动学、药效学、免疫学和血液学影响的I期和II期临床试验中评估了重组IL-10在炎性病症和自身免疫性疾病中的治疗好处(Moore,K.W.et al.,Annu.Rev.Immunol.19,683-765(2001)；Chernoff,A.E.et al.,J.Immunol.154,5492-5499(1995)；Huhn,R.D.et al.,Blood 87,699-705(1996)；Huhn,R.D.et al.,Clin.Pharmacol.Ther.62,171-180(1997))。IL-10以直到25μg/kg的剂量得到较好耐受，没有严重副作用，而且以直到100μg/kg的剂量只在一部分接受者中观察到温和至中等的流感样症状(Moore,K.W.et al.,Annu.Rev.Immunol.19,683-765(2001)；Chernoff,A.E.et al.,J.Immunol.154,5492-5499(1995))。在银屑病(临床研究的汇编可见于Mosser,D.M.&Yhang,X.,Immunological Reviews 226,205-218(2008))、克罗恩氏病(Van Deventer S.J.et al,Gastr本文档来自技高网...

【技术保护点】
IgG类抗体和突变型IL‑10分子的融合蛋白，其中该融合蛋白包含两条相同的重链多肽和两条相同的轻链多肽，且其中该突变型IL‑10分子包含与野生型IL‑10分子相比降低突变型IL‑10分子对IL‑10受体的结合亲和力的氨基酸突变。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.06 US 61/936,6421.IgG类抗体和突变型IL-10分子的融合蛋白，其中该融合蛋白包含两条相同的重链多肽和两条相同的轻链多肽，且其中该突变型IL-10分子包含与野生型IL-10分子相比降低突变型IL-10分子对IL-10受体的结合亲和力的氨基酸突变。2.权利要求1的融合蛋白，其中所述突变型IL-10分子在与人IL-10(SEQ IDNO:1)的残基87对应的位置处包含氨基酸替代。3.权利要求2的融合蛋白,其中所述氨基酸替代是I87A。4.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述突变型IL-10分子是两个突变型IL-10单体的同二聚体。5.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述突变型IL-10分子是人IL-10分子。6.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中每一条所述重链多肽包含IgG类抗体重链和突变型IL-10单体。7.权利要求6的融合蛋白，其中所述突变型IL-10单体在它的N末端融合至所述IgG类抗体重链的C末端，任选经由肽接头。8.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述重链多肽每一条基本上由IgG类抗体重链、突变型IL-10单体和任选的肽接头组成。9.权利要求6至8任一项的融合蛋白，其中所述重链多肽中包含的所述突变型IL-10单体形成功能性同二聚体突变型IL-10分子。10.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体包含如下修饰，与没有所述修饰的相应IgG类抗体相比，所述修饰降低抗体对Fc受体的结合亲和力。11.权利要求10的融合蛋白，其中所述Fc受体为Fcγ受体，特别是人Fcγ受体。12.权利要求10或11的融合蛋白，其中所述Fc受体为激活性Fc受体。13.权利要求10至12任一项的融合蛋白，其中所述Fc受体选自下组：FcγRIIIa(CD16a)，FcγRI(CD64)，FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。14.权利要求10至13任一项的融合蛋白，其中所述Fc受体为FcγIIIa，特别是人FcγIIIa。15.权利要求10至14任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体在抗体重链第329位(EU编号方式)处包含氨基酸替代16.权利要求15的融合蛋白，其中所述氨基酸替代为P329G。17.权利要求10至16任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体在抗体重链第234位和第235位(EU编号方式)处包含氨基酸替代。18.权利要求17的融合蛋白，其中所述氨基酸替代为L234A和L235A(LALA)。19.权利要求10至18任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体在抗体重链中包含氨基酸替代L234A、L235A和P329G(EU编号方式)。20.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体为IgG1亚类抗体。21.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体为全长抗体。22.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体为人抗体。23.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)。24.权利要求23的融合蛋白，其中当于25℃通过表面等离振子共振(SPR)测量时，该融合蛋白能够以小于1nM、特别是小于100pM的亲和常数(KD)结合FAP。25.权利要求23或24的融合蛋白，其中所述FAP为人、小鼠和/或食蟹猴FAP。26.权利要求23至25任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：37的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：41的HCDR 2、SEQ ID NO：49的HCDR 3、SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·埃姆里克，P·乌马纳，E·默斯纳，R·豪斯，J·费希尔，L·J·哈尼施，D·许，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH