Bt蛋白表达系统技术方案

本发明专利技术涉及Bt蛋白表达系统，属于生物技术领域。本发明专利技术Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体，其特征在于：载体pHT315插入有mcry1Ab/ac-C2序列，其启动子为cry1Ac启动子，所述mcry1Ab/ac-C2序列如SEQ ID NO：6所示。据此建立的Bt蛋白表达系统，能获得大量高纯度的Cry1Ab/Ac融合蛋白，为华恢1号等转基因水稻的安全评价及Cry1Ab/Ac蛋白标准物的制备奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
Bt蛋白表达系统
本专利技术涉及生物
,特别是涉及一种表达Cry1Ab/Ac融合蛋白的Bt蛋白表达系统。
技术介绍
水稻是我国主要的粮食作物之一，转基因水稻主要有抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆环境以及提高水稻品质等多个品种。转cry1Ab/Ac水稻(华恢1号)是华中农业大学自主培育的对二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等具有较强杀虫活性的水稻品种(FieldperformanceoftransgenicelitecommercialhybridriceexpressingBacillusthuringiensisdelta-endotoxin.TuJM,etal.NatureBiotechnology,2000,18(10):1101-1104)，2009年转Bt抗虫水稻华恢1号和汕优63获得生物安全证书(ThefirstapprovedtransgenicriceinChina.LuC.GMCrops,2010,1(3):113-115)，具有广阔的应用前景。但转基因作物可能会对动物等非靶标生物或生态环境产生一些非预期效应，所以推广转基因作物的前提是要确保其安全性。对转基因植物的评价主要从环境和食用安全性两方面考虑，食品安全性评价包括对营养成份、抗营养因子、毒性、过敏性、抗生素抗性等方面进行全面评估(转基因植物的食品安全性问题及评价策略.许文涛,等.生命科学,2011,23(2):179-185.)。这些安全评价都需要大量的高纯度目标蛋白，但水稻种表达的Cry1Ab/Ac含量极低，又不带有标签，很难纯化。
技术实现思路
本专利技术提供一种Bt蛋白表达系统，实现Cry1Ab/Ac融合蛋白在微生物中的高效表达，以获得大量高纯度的Cry1Ab/Ac融合蛋白，为华恢1号等转基因水稻的安全评价及Cry1Ab/Ac蛋白标准物的制备奠定基础。Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体，其特征在于：载体pHT315插入有mcry1Ab/ac-C2序列，表达载体的启动子为cry1Ac启动子，所述mcry1Ab/ac-C2序列如SEQIDNO：6所示。Bt蛋白表达系统，为插入有上述Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体的苏云金芽胞杆菌菌株。所述苏云金芽胞杆菌菌株为无晶体蛋白的HD73-菌株。上述表达载体或表达系统在生产高纯度Cry1Ab/Ac融合蛋白中的应用。所述应用为采用上述Bt蛋白表达系统表达Cry1Ab/Ac融合蛋白，再经提取和纯化而得到。所述表达Cry1Ab/Ac融合蛋白为将菌株置于1/2LB固体培养基中，30℃培养。所述纯化方法为将提取的Cry1Ab/Ac蛋白先经脱盐柱G-25脱盐，再将蛋白样品进行阴离子交换层析，最后再使用脱盐柱G-25进行脱盐。所述脱盐条件为：柱平衡缓冲液为50mMNa2CO3缓冲液，pH10.5；流速为2mL/min，阴离子交换层析条件为：柱平衡缓冲液为50mMNa2CO3缓冲液，pH10.5；流速为2mL/min，以0-100％的1MNaCl进行梯度洗脱。植物表达的Bt蛋白以可溶状形式存在，而在cry基因在大肠杆菌的表达系统中表达多形成包涵体，影响生物安全评价的结果，因此本专利技术采用Bt表达系统来表达cry1Ab/Ac杂合基因。根据转基因水稻TT51转化事件中的氨基酸序列(Cry1Ab/Ac氨基酸序列如SEQIDNO：1所示)合成mcry1Ab/ac基因(如序列SEQIDNO：2)，为保证mcry1Ab/ac在苏云金芽胞杆菌中形成稳定的晶体，合成C1(SEQIDNO：3)和C2(SEQIDNO：4)序列。启动子为cry1Ac启动子(己知序列)，将mcry1Ab/ac-C1(SEQIDNO：5)序列和mcry1Ab/ac-C2(SEQIDNO：6)序列分别BamHI和SalI酶切后连入载体pHT315(己知载体)中。分别将验证正确的克隆用电击转化法，转入HD73-菌株，获得重组Bt菌株HD-1Ab/AcC1和HD-1Ab/AcC2。光学显微镜下观察：菌株HD-1Ab/AcC2可以形成双锥体型晶体(图1)，而菌株HD-1Ab/AcC1则观察不到任何性状的晶体，说明mcry1Ab/ac-C1杂合基因在Bt的表达系统中不能形成稳定的晶体结构。SDS-PAGE结果显示，获得得大小为130kDa的蛋白(图2A)。然后对130kDa进行胰蛋白酶消化，获得约为60kDa的杂合蛋白mCry1Ab/Ac(图2B)，这与转cry1Ab/Ac基因水稻中的外源蛋白大小相同。消化后的核心片段先用G-25脱盐柱进行脱盐，然后再进行阴离子交换纯化(图3)，最后再进行脱盐，最终得到纯度较高的蛋白(图4)。经鉴定，mCry1Ab/Ac蛋白的纯度为97％(图5)。菌株HD-1Ab/AcC2菌株接种于含有50ml1/2LB培养基的500ml三角瓶中培养，共20个三角瓶，获得1L菌液，按照本研究蛋白提取及纯化方法共获得150ml纯蛋白，对获得的纯蛋白用Thermo公司的BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，BSA蛋白标准曲线见图7，根据公式计算，纯蛋白的浓度为0.21μg/μl。1L菌液获得可溶状态纯蛋白31mg。本专利技术的Bt蛋白表达系统，能获得大量高纯度的Cry1Ab/Ac融合蛋白，为华恢1号等转基因水稻的安全评价及Cry1Ab/Ac蛋白标准物的制备奠定基础。附图说明图1Bt菌株HD-1Abc光学显微镜观察结果，其中S.芽胞；C.晶体，图2杂合蛋白Cry1Ab/Ac-C2(A)与杂合蛋白mCry1Ab/Ac(B)SDS-PAGE检测，图3阴离子交换纯化流程，图4高纯度mCry1Ab/Ac蛋白的DSD-PAGE检测，图5杂合蛋白mCry1Ab/Ac的纯度分析，图6菌株Cry1Ab/Ac-C2(C)及水稻TT51(T)总蛋白的WesternBlot分析，图7BSA蛋白标准曲线。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明。实施例11.1实验材料菌株与质粒本文所用菌株和质粒见(表1)，可以对公众发放。表1菌株与质粒1.2试剂1.2.1培养基液体LB：Tryptone10.0g，Yeastextract5.0g，NaCl10.0g，加水定容到1000mL，调pH7.0，15磅20min。固体LB：在液体培养基中加入1.3％的琼脂。1/2固体LB：Tryptone5.0g，Yeastextract2.5g，NaCl5.0g，加水定容至1000mL，加入1.3％琼脂粉，调pH至7.0，15磅20min。1.2.2抗生素氨苄青霉素，配制成100mg/mL的水溶液，用一次性滤器0.22μm过滤除菌，置于-20℃保存。氯霉素、红霉素用无水乙醇溶解，配制成34mg/mL溶液，置于-20℃保存。1.2.3化学试剂及酶试剂限制性内切酶及2×连接试剂盒、2×Taqmix、2×PrimerStarmix均购自TaKaRa公司。E.coli质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自美国Axygen公司。各种抗生素均购自美国Amresco公司；酪蛋白(α-casein)、大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybeantrypsininhibitor,STI)、胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin),均购自Solarbio公司；常规化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。其本文档来自技高网...

【技术保护点】
Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体，其特征在于：载体pHT315插入有mcry1Ab/ac‑C2序列，表达载体启动子为cry1Ac启动子，所述mcry1Ab/ac‑C2序列如SEQ ID NO：6所示。

【技术特征摘要】
1.Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体，其特征在于：所述表达载体通过在载体pHT315插入mcry1Ab/ac-C2序列获得，表达载体启动子为cry1Ac启动子，所述mcry1Ab/ac-C2序列如SEQIDNO：6所示。2.Bt蛋白表达系统，为转入权利要求1所述的Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体的苏云金芽胞杆菌菌株，所述苏云金芽胞杆菌菌株为无晶体蛋白的HD73-菌株。3.权利要求1所述的Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体或权利要求2所述Bt蛋白表达系统在生产Cry1Ab/Ac融合蛋白中的应用。4.权利要求3所述的应用，为采用权利要求2所述的Bt蛋白表达系统表达Cry...

【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，耿丽丽，束长龙，彭琦，宋福平，梁影屏，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11