本发明专利技术公开了一种人工合成的编码硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域的LSL基因以及含有LSL基因的表达载体、宿主细胞，LSL基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。本发明专利技术还公开了一种以LSL作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法，该方法具体涉及LSL基因合成、含LSL基因和目标蛋白基因的表达载体构建、含LSL基因和蛋白酶基因的表达载体构建、融合蛋白的表达与纯化、LSL蛋白标签去除和目标蛋白纯化等步骤。本发明专利技术方法简单易行，实现了目标蛋白一步纯化，可获得高纯度的目标蛋白，降低了蛋白纯化成本，可广泛用于生物医药、兽药等领域的活性蛋白质以及生物制品行业中疫苗抗原的规模化制备，具有较高的实用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体设及一种W硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基 乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法。
技术介绍
随着基因工程技术、基因组学和蛋白质学技术的发展，重组蛋白已经广泛应用于 生物、医药、农业和畜牧兽医等多种领域。然而，大规模生产和纯化性状确切的蛋白仍然是 重组蛋白技术中的难点。重组蛋白的表达系统有原核和真核两大类。真核表达体系有酵母、 昆虫和哺乳动物细胞表达体系等。相对于真核表达体系的繁琐过程和较高的成本，W大肠 杆菌为代表的原核表达体系具有宿主菌背景清晰、表达量高、易于操作和生产成本低等诸 多优点。 在规模化生产重组蛋白过程中，合适的融合标签对于目标蛋白的可溶性表达和下 游的蛋白纯化与检测均具有举足轻重的作用。常用的融合标签包括蛋白质标签和多肤片段 标签。大的蛋白质标签有谷脫甘肤S-转移酶（GST)，麦芽糖结合蛋白（MBP)，硫氧还原蛋白 A(TrxA),葡萄球菌蛋白A(SPA),小泛素相关修饰蛋白（SUMO)等，它们的使用会增加目标蛋 白的溶解性，但在蛋白结晶和抗体产生等过程中，标签必须去除。常见的小的多肤标签有六 聚组氨酸化X化S)、流感病毒血凝素表位（HA)、人c-myc蛋白表位（c-myc)、W及8个氨基 酸值Y邸孤DK)组成的一个短肤FLAG标签等。利用上述标签，可W通过亲和层析技术纯化 目标蛋白。虽然运些标签各具优点并得到广泛应用，但在规模化制备和纯化蛋白时，仍存在 成本高的缺点。因此，研究和开发新的融合标签用于蛋白质的高效表达和纯化仍然很有必 要。 凝集素是各种植物，无脊椎动物和高等动物均存在的一类对糖蛋白上的糖链具 有高度特异性的结合蛋白。可专一识别某种糖并与之非共价地、可逆地结合，如刀豆素与 a-D-化喃糖基甘露糖（a-D-Mannopyranosy)结合；麦芽素与N-乙酷糖胺（N-acet^ glucosamine)结合；菜豆凝集素与N-乙酷乳糖胺结合。利用凝集素与某种糖特异、可逆结 合的特性，在实验室中，将凝集素与固相载体结合来纯化各种糖类和糖蛋白，同时也用偶联 于固相介质上的某种糖来纯化凝集素。1994年Konska等人从硫横菌中分离出能特异性结 合N-乙酷氨基乳糖的溶血性凝集素--硫横磨茹菌凝集素化onskaG,GuillotJ,Dusser M,etal.IsolationandCharacterizationofanN-Acetyllactosamine-BindingLectin fromtheMushroomLaetiporussulfurous.JBiochem, 1994, 116(3):519-23),Hiroaki 等研究发现该凝集素可W结合琼脂糖（Se地arose),并能用乳糖竞争性洗脱（Tateno H,GoldsteinIJ.Molecularcloning,expression,andcharacterizationofnovel hemolyticlectinsfromthemushroomLaetiporussulphureus,whichshowhomology tobacterialtoxins.JBiolChem. 2003, 278 (42): 40455-40463)。因此，本研究拟在利用 硫横菌磨茹凝集素作为蛋白表达和纯化的标签，建立目标蛋白表达与纯化的高效、廉价方 法。但是，由于天然的硫横菌磨茹凝集素基因较长，完整的基因有900多个核巧酸，翻译成 约300个氨基酸，不适于用作融合蛋白标签进行目标蛋白的高效表达。现有的研究表明，天 然硫横菌磨茹凝集素与乳糖结合的功能域主要位于N端的第1-187为氨基酸，因此，本申请 只表达硫横菌磨茹凝集素N端的第1-187个氨基酸组成的区域（简称为硫横菌磨茹凝集素 N-乙酷氨基乳糖结合域）作为蛋白表达和纯化的标签，建立目标蛋白高效表达与纯化的方 法。该硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖结合域的氨基酸序列为SEQIDNO. 2所示的氨 基酸序列，大小为21. 3kDa，编码该区域的基因的核巧酸序列为SEQIDNO. 3所示的核巧酸 序列，长度为56化P。 此外，由于每种生物在对基因进行翻译时对密码子的利用率有较大差异，运种差 异直接影响基因表达的水平。而磨茹凝集素作为一种真菌蛋白，其密码子在大肠杆菌中的 利用率较低，将直接导致后续的标签蛋白和目的蛋白的表达量较低，而且容易导致表达的 蛋白不可溶。为了解决运个问题，本专利技术根据大肠杆菌密码子嗜好性，对天然的硫横菌磨茹 凝集素N-乙酷氨基乳糖结合域的基因序列进行优化，使其密码子在大肠杆菌中具有高利 用率，使得硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域可在大肠杆菌中高水平、可溶性表 达，从而提供一种W硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋 白表达与纯化方法。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种人工优化合成的能够编码 硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域的L化基因；本专利技术的另一目的是提供含有上 述人工合成的LSL基因的表达载体和宿主细胞；本专利技术的再一目的是提供一种W硫横菌磨 茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化的方法。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下： 本专利技术首先提供了一种编码硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域的LSL 基因，所述L化基因的核巧酸序列为SEQIDNO. 1所示，所述L化基因编码的蛋白的氨基酸 序列如沈QIDNO. 2所示。 本专利技术还提供了一种包含所述的L化基因的表达载体。 优选地，上述的包含L化基因的表达载体为祀T28a-LSL所述表达载体 祀T28a-L化是W祀T28a(+)为起始质粒载体构建的，所述表达载体祀T28a-L化还包括化O I限制性核酸内切酶识别位点、化nI限制性核酸内切酶识别位点、BamHI限制性核酸内切 酶识别位点和蛋白酶识别位点。 进一步的，本专利技术还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞为包含上述的L化基因 (其核巧酸序列为SEQIDNO. 1所示）的宿主细胞，或者为包含上述表达载体的宿主细胞。 本专利技术还提供了一种利用上述L化基因编码合成的硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨 基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法，包括W下步骤： (1)标签基因的构建： 人工合成编码硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域的L化基因，所述LSL 基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示，然后在L化基因的5'端加上限制性核酸内切酶1 的识别位点，在其3'端依次加上限制性核酸内切酶2的识别位点、蛋白酶识别位点和限制 性核酸内切酶3的识别位点，形成标签基因； (2)表达载体1的构建： 用限制性核酸内切酶1和3对标签基因进行双酶切处理，然后将双酶切后回收得 到的含有L化基因的基因片段用DNA连接酶与经过同样双酶切处理的大肠杆菌表达载体进 行连接，得到含有L化基因片段的表达载体1; (3)表达载体2和表达载体3的构建：a.目标蛋白基因序列的合成：参照目标蛋白的基因序列，人工合成目标蛋白基 因，并在目标蛋白基因的5'端加上限制性核酸内切酶3的识别位点，在其3'端加上限制性 核酸内切酶4的识别位点；b.用限本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码硫磺菌蘑菇凝集素N‑乙酰氨基乳糖胺结合域的LSL基因，其特征在于，所述LSL基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵军，王川庆，高冬生，杨霞，常洪涛，陈陆，王新卫，李永涛，刘红英，姚慧霞，李晓静，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。