本发明专利技术公开了一种提高人胱抑素C蛋白在大肠杆菌中可溶性表达量的发酵方法，该编码基因的核苷酸序列SEQ ID NO：1，重组人胱抑素C的表达方法，包括以下步骤：直接合成并优化密码子，将重组人胱抑素C插入到原核表达载体的多克隆位点，构建重组表达质粒，将重组表达质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌，筛选阳性克隆，得工程菌，工程菌经发酵、诱导、分离、纯化，得重组人胱抑素C。通过优化发酵罐的溶氧，pH，搅拌速率，补料条件，使蛋白的产量可以达到0.4g/L，且活性和天然胱抑素C蛋白相近。本发明专利技术提供的重组胱抑素C发酵放大生产方法，操作简单，且表达的胱抑素C产量高达0.4g/L，纯度达到95％以上，同时利用重组人胱抑素C蛋白制备多抗血清和标准品，目前未见表达效率更好的报道。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学工程领域，特别涉及一种提高人胱抑素C蛋白在大肠杆菌中 可溶性表达量的方法。
技术介绍
胱抑素C即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白，1983年Anastasi等首次在鸡蛋清中分离纯 化得到高纯度的半胱氨酸酶抑制剂，后被命名为胱抑素C，也被称为Y-微量蛋白及Y-后 球蛋白，广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中，是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质， 分子量为13. 3KD，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循 环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志 物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液，因此，其血中浓度由肾 小球滤过决定，而不依赖任何外来因素，如性别、年龄、饮食的影响，是一种反映肾小球滤过 率变化的理想标志物，可作为肾小球滤过功能指标，比目前常用的肾功能检测项目有更高 的灵敏度和特异性，其血清浓度是替代传统的血尿素和内生肌酐清除率测定的首选功能评 价指标。 由于胱抑素C及抗体的来源受限，现有胱抑素C的试剂盒价格昂贵，妨碍其在国内 推广应用。目前，通常采用PCR技术调取胱抑素C编码基因，克隆后进行重组表达，但表达 效率极低，难以满足市场需求，为此我们通过优化胱抑素C的编码基因，建立了重组胱抑素 C蛋白的制备体系，以期解决胱抑素C的来源问题，同时经过发酵罐优化发酵条件，大量提 高胱抑素C的表达量，为胱抑素C检测试剂盒的研发提供优质原料。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人胱抑素C蛋白在大肠杆菌中可溶性表达量的方法。 重组胱抑素C表达方法包括如下步骤： 1.将目的基因的5'端加入NcoI酶切位点，3'加入XhoI酶切位点酶切位点， 进行全序列合成，获得合成序列； 2.将合成的序列从puc57载体切下，插入至原核表达载体的多克隆位点，构建重 组表达质粒，将重组表达质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌，筛选出阳性克隆菌，获得工程 菌； 3?原核表达载体为pET22b(+)，表达宿主为DE3(E.coliRosetta)。提高重组胱抑素C可溶性表达量的步骤 1.为了实现本专利技术目的，一种提高人胱抑素C蛋白在大肠杆菌中可溶性表达量的 方法，将CYS-C-PET22b(+)转化大肠杆菌DE3(E.coliRosetta)，在诱导后的上清中，重组 人胱抑素C呈可溶性表达。通过发酵罐放大优化提高了可溶性蛋白的表达量。 2.利用单因子实验确定最佳IPTG、溶氧、pH及温度。 3.具体可采用以下方法验证实际发酵过程中IPTG、溶氧、pH和转速。 4.利用IOOL发酵罐，以工程菌进行发酵实验，在初始培养基中添加lOg/L葡萄糖， 在发酵过程中用氨水控制pH在6. 5-8. 0,温度控制在25-38°C，通过调整搅拌和通气量控制 溶氧在20%以上，通过调整补加葡萄糖液和酵母提取液速度控制发酵液中剩余葡萄糖的量 为0. 1-0. 6g/L，发酵周期为25-30h，实验结果表明发酵过程中控制葡萄糖的量，可以有效 提1?脈抑素C的广量。 5.通过补料批式发酵，使得胱抑素C产量可以达到0.4g/L，成本低廉，适于大规模 生产，降低胱抑素C试剂盒成本，因而具有较好的产业价值。 6.经已获得注册号的进口体外诊断试剂盒于BECKMAN全自动生化分析仪检测，活 性达90%以上。制备重组胱抑素C多抗血清的方法 1.为了更好地利用重组胱抑素C蛋白制备抗血清，本专利技术免疫动物制备血清。 2.前述的方法，选用的动物优选为新西兰兔。 3.本专利技术还公开了利用上述血清制备重组人胱抑素C蛋白制备诊断试剂标准品。 4?所述的合适浓度为10-200ng/ml，以此标准品按梯度稀释，在10ng/mL-200ng/ mL范围内，线性偏差< 5%。【附图说明】 图1为制备重组胱抑素C的流程示意图图2为重组人胱抑素C表达产物的SDS-PAGE分析，其中M=Marker，1:破碎菌体包 涵体，2:破碎菌体上清 图3为发酵时间对胱抑素C可溶性表达量的影响，其中M:Marker，1:诱导前，2:诱 导后lh，3:诱导后2h，4:诱导后4h，5:诱导后8h 图4为胱硫醚beta合酶纯化后的SDS-PAGE分析，其中M:Marker，1:纯化后的胱 抑素C蛋白 图5为制备胱抑素C诊断标准品评价结果 图6为发酵策略对产胱抑素C细胞产量的影响 具体实施方案 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。 实施例1 重组胱抑素C表达方法如下步骤1)将目的基因的5'端加入NcoI酶切位点（CCATGG)，3'加入XhoI酶切位点 (CTCGAG);通过全序列合成获得目的序列。 2)将获得序列用NcoI和XhoI进行双酶切，纯化得到目的基因，原核表达载体 pET22b(+)经相同的酶切处理，纯化大片段基因，并与双酶切后得到的目的基因连接，转入 感受态细胞DH5a，测序确定成功，抽提质粒，获得重组表达质粒CYS-C-pET22b(+)。 3)将重组表达质粒CYS-C-pET22b(+);转入感受态表达宿主菌DE3 (E.coli Rosetta)中，涂布于LB固体培养基（含IOOiig/ml硫酸卡那霉素）上，37°C培养16h，筛选 出阳性克隆菌为工程菌。 4)将工程菌接种至LB培养液（含50iig/ml硫酸卡那霉素）中，37°C培养，待菌液 〇D6。。?至 〇? 5 时，加入终浓度为 0? 5mmol/l的IPTG，37°C培养 4h。4°C，12000rpm离心IOmin 分离得到诱导表达上清液和菌体。 5)将菌体用BindingBuffer洗涤1次后，冰上超声破菌，离心收集上清液，12% SDS-GAGE检测蛋白表达量。 6)将超声破菌，离心收集上清液，将上清液加入镍层析柱，依次加入Binding Buffer,WashBuffer,最后EluteBuffer进行目的蛋白洗脱，收集EluteBuffer洗脱蛋 白，得重组胱抑素C蛋白，采用12 %SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的纯度（如图2)。 7)从图中可以看出，纯化后的蛋白纯度大于95%。 实施例2 优化发酵条件提高重组胱抑素C可当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高人胱抑素C蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于，通过分子操作构建获得表达载体CYS‑C‑pPET22b(+)，转化宿主DE3(E.coli Rosetta)，获得工程菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李小红，孔毅荣，刘强，于海双，
申请(专利权)人：北京嘉万生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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