本发明专利技术公开了一种表达胶原酶的大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明专利技术一种蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus R75E分泌的一种胶原酶的氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)与核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示)。本发明专利技术提供含有上述胶原酶基因在大肠杆菌中的表达菌。本发明专利技术提供一种含有表达所述DNA分子的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是在宿主菌中导入所述的大肠杆菌重组表达载体得到的大肠杆菌菌株。本发明专利技术提供一种纯化所述重组胶原酶的方法及在降解鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白方面的应用。本发明专利技术的重组胶原酶，能够高效降解天然的Ⅰ型胶原蛋白纤维，效果显著，可应用于农副产品中胶原蛋白的开发利用、水产品胶原蛋白的加工与利用、医疗以及食品工业生产中胶原酶的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种胶原酶的DNA分子，及其在大肠杆菌中的表达、纯化重组胶原酶的方法及胶原酶在降解胶原蛋白方面的应用。
技术介绍
胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。根据胶原酶的来源可分为动物胶原酶与微生物胶原酶。其中，微生物胶原酶以底物范围广、酶切位点多、生产成本低等优点被广泛应用。目前已发现的可产生胶原酶的微生物主要分布于芽孢杆菌属，其中典型的类型有：梭状芽孢杆菌(Clostridiumhistolycum)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)等。但是由于这些微生物胶原酶是从微生物上清中提取的,成分复杂,有时可能还含有其它毒素,并且产量较低,因此,目前在应用中还存在不少问题。通过基因工程的手段大量生产微生物胶原酶可以克服这个问题。目前，高纯度微生物胶原酶的生产制备工艺已成为国内外研究的热点，我国在微生物胶原酶的应用还处于刚起步阶段，由于高纯度胶原酶的提取工艺复杂，生产成本高，国内市场依赖大量高价进口胶原酶产品，限制了微生物胶原酶的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种表达胶原酶的大肠杆菌及其构建方法与应用。本专利技术的第一个目的在于提供一种蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus R75E(保藏编号为：CGMCC NO.8614)分泌的一种胶原酶的氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)与核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示)。本专利技术的第二个目的在于提供含有上述胶原酶基因在大肠杆菌中的表达 菌。本专利技术的第三个目的在于提供一种纯化重组胶原酶的方法。本专利技术的第四个目的在于提供上述胶原酶在降解胶原蛋白方面的应用。为实现本专利技术的目的所采用的技术方案是：一种胶原酶蛋白质分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。一种可编码胶原酶基因的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。一种含有所述可编码胶原酶基因的DNA分子的大肠杆菌重组表达载体，所述大肠杆菌重组表达载体为在pET28a质粒载体的多克隆位点插入所述的DNA分子得到的重组质粒。所述大肠杆菌重组表达载体为在pET28a载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间插入所述DNA分子得到的重组质粒。一种含有表达所述DNA分子的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是在宿主菌中导入所述的大肠杆菌重组表达载体得到的大肠杆菌菌株，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株；所述大肠杆菌重组菌是将上述DNA分子通过所述重组表达载体导入大肠杆菌中得到的大肠杆菌重组菌，该大肠杆菌重组菌命名为ColB-RZ1，保藏编号为CGMCC No.10684。一种纯化所述重组胶原酶的方法，按照下述步骤进行：(1)培养上述所得到的大肠杆菌重组菌ColB-RZ1，直至OD600nm为0.6-0.8之间,向培养液中加入最终浓度为0.1mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，在22℃条件下振荡诱导培养16h；(2)室温下收集大肠杆菌菌体，用超声破碎的方法将菌体破碎，将破碎后的裂解液离心，离心后对含有可溶性重组胶原酶的上清组分过滤除菌，得到无菌上清重组胶原酶液；(3)将步骤(2)中所述的无菌上清重组胶原酶液加入蛋白纯化柱(cOmpleteHis-TagPurification Column)，挂柱条件为：①用5倍柱体积超纯水以1mL/min的流速洗柱(cOmpleteHis-TagPurification Column)；②5倍柱体积的缓冲液1以1mL/min的流速过柱；③以0.1mL/min的流速将10倍柱体积无菌上清重组胶原酶液加入蛋白纯化柱(cOmpleteHis-TagPurification Column)；④用5倍柱体积的缓冲液1以1mL/min的流速洗涤蛋白纯化柱 (cOmpleteHis-TagPurification Column)；⑤用缓冲液2洗涤蛋白纯化柱(cOmpleteHis-TagPurification Column)，监测蛋白的洗脱情况，并收集洗脱下来的蛋白既得重组胶原酶；其中，缓冲液1的组成为：20mmol/L PBS,pH值为7.4,内含1mmol/L PMSF及20mmol/L咪唑；缓冲液2的组成为：20mmol/L PBS,pH值为7.4,内含1mmol/L PMSF及250mmol/L咪唑。一种所述重组胶原酶在降解鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白方面的应用，具体步骤如下：(1)将纯化所得的重组胶原酶按照1:40的体积比与草鱼鱼鳞中的Ⅰ型胶原蛋白混合，在37℃水浴条件下反应；(2)在步骤(1)中所述的反应分别进行至0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、120min时，终止反应，对反应产物做SDS-PAGE电泳分析。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术的由基因工程菌株生产胶原酶的工艺具有易操作、产量大等特点，有利于胶原酶制剂应用于工业生产中。2、本专利技术的重组胶原酶，能够高效降解天然的Ⅰ型胶原蛋白纤维，效果显著，可应用于农副产品中胶原蛋白的开发利用、水产品胶原蛋白的加工与利用、医疗以及食品工业生产中胶原酶的应用，例如：细胞培养时去除细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、降解富含胶原的肉食品(如牛肉)中过多的胶原进而使肉制品鲜嫩可口、临床治疗一些胶原沉积性疾病如:烧伤、手术后过度增殖性瘢痕的降解、腰椎间盘突出症等等。3、本专利技术的重组胶原酶经检测其活力高于目前市场上广泛应用的梭状芽孢杆菌所产的Ⅰ型胶原酶8.65倍，表明本专利技术的重组胶原酶具有极强的实际应用价值，对于解决国内胶原酶长期依赖国外产品的困境有显著的应用前景与战略意义。附图说明图1所示为本专利技术蜡样芽孢杆菌R75E菌株胶原酶基因的PCR扩增结果，图中：M为DNA标准；1为胶原酶基因扩增片段；图2所示为本专利技术构建的pET28a/Collagenase重组质粒经BamH Ⅰ与Xho Ⅰ 两个限制性内切酶双酶切后产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图中：M为DNA标准；1为双酶切后的产物；其中分子量大的条带是pET28a质粒载体片段，分子量小的条带是胶原酶基因片段；图3为本专利技术构建的pET28a/Collagenase重组质粒的图谱；pET28a/Collagenase重组质粒的分子大小共为8230bp，将长度为2895bp(不含终止子密码子)的编码胶原酶的DNA分子片段插入pET28a质粒载体(全长5335bp)中的BamHⅠ与XhoⅠ两个酶切位点之间；图4所示为IPTG诱导前后大肠杆菌中重组胶原酶表达情况的SDS-PAGE电泳分析结果，图中：M为蛋白标准；1为IPTG诱导前的重组菌体蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胶原酶蛋白质分子，其特征是，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种胶原酶蛋白质分子，其特征是，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所
示。
2.一种可编码胶原酶基因的DNA分子，其特征是，其核苷酸序列如SEQ ID
NO:2所示。
3.一种含有所述可编码胶原酶基因的DNA分子的大肠杆菌重组表达载
体，其特征是，所述大肠杆菌重组表达载体为在pET28a质粒载体的多克隆位
点插入所述的DNA分子得到的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的含有所述可编码胶原酶基因的DNA分子的大肠
杆菌重组表达载体，其特征是，所述大肠杆菌重组表达载体为在pET28a载体
的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点之间插入所述DNA分子得到的重组质粒。
5.一种含有表达所述DNA分子的重组大肠杆菌，其特征是，所述重组大
肠杆菌是在宿主菌中导入权利要求3或4所述的大肠杆菌重组表达载体得到
的大肠杆菌菌株，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株；所述重组大肠杆
菌是将权利要求2所述的DNA分子通过所述重组表达载体导入大肠杆菌中得
到的重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌命名为ColB-RZ1，保藏编号为CGMCC
No.10684。
6.一种纯化重组胶原酶的方法，其特征是，按照下述步骤进行：
(1)培养上述权利要求5得到的的重组大肠杆菌，直至OD600nm为0.6-0.8
之间,向培养液中加入最终浓度为0.1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,
在22℃条件下振荡诱导培养16h；
(2...
【专利技术属性】
技术研发人员：阮海华，张西轩，李晔，杜康龙，张真，
申请(专利权)人：天津商业大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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