本发明专利技术涉及一种利用大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin和制备抗菌肽apidaecin的方法，将AP2基因和多角体基因序列polh克隆入重组载体中形成带有polh-AP融合基因片段的重组载体；接着polh-AP融合基因片段克隆入表达载体，将表达载体转化表达宿主细胞，表达宿主细胞经培养表达带有所述抗菌肽AP2的融合蛋白。将表达宿主细胞进行培养，诱导重组蛋白polh-AP的表达，将诱导后的菌株离心收集，重悬后超声波破碎，离心收集不溶性包涵体，纯化收集重组蛋白样品。与现有技术相比，该表达系统培养程序简单，生产成本低，能高效的表达抗菌肽apidaecin，且使得AP2与polh融合表达，不仅有效降低AP2对大肠杆菌的毒性，提高抗菌肽的稳定性，让抗菌肽高水平表达，且方便纯化处活性抗菌肽，提高抗菌肽apidaecin的产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种通过大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin和 制备抗菌肽apidaecin的方法。
技术介绍
近年来抗生素的大量滥用已使我国畜牧养殖业走向恶性循环，严重威胁着我们的 食品安全和人类健康。抗菌肽是由生物体基因之间编码产生的一类能抵抗外界病原体感染 的小分子肽，具有理化性质稳定、无免疫原性、抗菌谱广等特性，其抗菌活性和抗菌效应与 抗生素非常接近，在替代抗生素方面显示了巨大的潜力。apidaecin是一类富含脯氨酸的抗 菌肽，由于其独特的抑菌作用机制而备受关注，研究表明，apidaecin能特异地作用于革兰 氏阴性菌，对大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌和乙酸钙不动杆菌等致病菌均具有普遍的 杀伤作用。因此，apidaecin对解决因革兰氏阴性菌而导致的抗生素抗性危害不断加重的 问题具有特殊意义。 目前，抗菌肽可通过以下途径获得：1、从生物体提取纯化；2、化学合成；3、基因工 程，其中前两种方法由于成本和技术问题，不适于抗菌肽的工业化生产，基因工程方法是目 前最有潜力的途径。Apidaecin已在不同的宿主中表达，如链霉菌、乳酸乳球菌等，Taguchi 将apidaecin异构体Hblb (API)的编码基因通过编码Xa特异切割位点的连接子连接于链 霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂，该融合基因在浅青紫链霉菌菌株中获得了成功的分泌表达； 孙超等将apidaecin与泛素融合后在在乳酸乳球菌nisin诱导表达系统中进行表达，纯化 后的apidaecin具有抑菌活性；周绪霞等在乳酸乳球菌nisin诱导表达系统中成功分泌表 达了具有生物活性的apidaecin。上述表达均存在表达量低，成本昂贵的问题，无法达到实 际应用的要求。 大肠杆菌表达系统是一种比较成熟的原核表达系统，apidaecin蛋白在大肠杆 菌表达系统中也能获得融合表达，但即使是融合表达，融合状态的apidaecin仍表现出对 宿主的毒性，apidaecin表达量越高，宿主细胞的生长越受到限制，即使本底水平表达的 apidaecin都会对宿主细胞的生长造成威胁,加上apidaecin分子小,宿主细胞蛋白酶降解 导致其绝对产量低，且其在大肠杆菌中过量表达是以包涵体的形式存在，因此其复性、纯化 也是难题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用大肠杆 菌高效表达抗菌肽apidaecin的方法。 本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种产量高的抗菌肽apidaecin的制 备方法。 本专利技术解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种利用大肠杆菌表达抗菌肽 apidaecin的方法，其特征在于：将如SEQID NO. 1所述的AP2基因克隆入重组载体中，形成 带有AP2基因的重组载体，然后将表达BmNPV的多角体基因序列polh克隆入所述带有AP2 基因的重组载体中AP2基因的上游，即形成带有polh-AP融合基因片段的重组载体；接着 polh-AP融合基因片段克隆入表达载体，得到带有polh-AP融合基因片段表达载体，该带有 polh-AP融合基因片段表达载体转化表达宿主细胞，表达宿主细胞经培养表达带有所述抗 菌肽apidaecin的融合蛋白。 上述方案中，所述克隆载体为pUC57,则所述带有AP2基因的重组载体为 PUC57-AP，所述带有polh-AP2融合基因片段的重组载体为pUC57-polh-AP ;所述表达载体 为PET30,则所述带有polh-AP融合基因片段表达载体为pET-polh-AP。 进一步，所述AP2基因的上游加入羟胺裂解位点编码序列，然后在该基因片段的 5'端加入EcoR 1，3'端加入Xho I，合成后克隆入所述pUC57。 进一步，从BmNPV基因组中PCR克隆所述多角体基因序列polh(Gene ID:787288)， PCR的正向引物带Nco I酶切位点：5 ' -AACCCATGGATATGCCGGATTATTCATAC-3 '，反向引物带 EcoR I 酶切位点：5' -TCGTGAATTCATACGCCGGACCAG TG-3'。 进一步，所述克隆宿主细胞为E. coli DH5a，所述表达宿主细胞为E. coli BL21。 本专利技术解决第二个技术问题所采用的技术方案为：培养带pET-polh-AP克隆的 E. coli BL21，直到菌液的0D600达到0. 6时，加入终浓度为ImM的IPTG，诱导重组蛋白 polh-AP的表达，将诱导后的菌株离心收集，用pH7. 8的PBS进行重悬，再超声波破碎，把破 碎后的菌液4°C下15000rpm离心30min，收集不溶性包涵体，纯化收集重组蛋白样品。 上述方案中，纯化收集重组蛋白样品的过程中，首先使用pH9的PBS进行重悬浮， 震荡溶解30min，离心收集不溶性包涵体，然后将收集的不溶性包涵体继续用pH12的PBS进 行重悬浮，震荡溶解30min，离心收集溶解后的蛋白，将所得蛋白溶液的pH值调节到pH7. 8， 室温静置2h，离心收集沉淀的蛋白质。 进一步，将所得重组蛋白的浓度调整为15mg/ml，然后将该重组蛋白溶液与3倍体 积的羟氨裂解反应缓冲液混合，55°C孵育24h，polh-AP融合蛋白裂解得裂解反应样品，将 该裂解反应样品用20mM PBS透析、离心，获得AP上清，冻干保存。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于：与其他原核表达系统相比，大肠杆菌表达系 统培养程序简单，生产成本低，能高效地表达抗菌肽apidaecin，且在AP2基因片段上游加 入BmNPV的多角体基因序列polh，使得AP2与polh融合表达，不仅有效降低AP2对大肠杆 菌的毒性，提高抗菌肽的稳定性，让抗菌肽高水平表达，且利用多角体蛋白的碱溶解性方便 纯化处活性抗菌肽，提高抗菌肽apidaecin制备的产量。【附图说明】 图1为本专利技术实施例1中pET-polh-AP表达载体的构建路线图； 图2为本专利技术实施例2中polh-AP在E. coli BL21中的表达情况示意图。【具体实施方式】 以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。 材料： AP2基因片段由上海生工生物工程有限公司合成； E. coli DH5 α和E. coli BL21感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司； 质粒pUC57、ρΕΤ30和Ε. coli Κ88菌株为浙江大学动物科学学院李卫芬教授实验 室保存； IPTG购于上海生工生物工程有限公司。 实施例1 :pET-polh-AP表达载体的构建 化学合成AP2基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述，该基因表达的AP2蛋 白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述，合成时在其5'端加入EcoR I位点和羟胺裂解位点 编码序列（Asn-Gly)，3'端加入Xho I位点。如图1所示，将上述片段嵌入到pUC57中，得 到含有AP基因的重组质粒pUC57-AP (生工提供)。从BmNPV基因组中PCR克隆得到多角体 基因序列 polh (Gene ID:7872889)，PCR 克隆的正向引物为 5'-AACGAATTCATATGCCGGATTAT TCATAC-3'（Nco 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin的方法，其特征在于：将如SEQID NO.1所述的AP2基因克隆入重组载体中，形成带有AP2基因的重组载体，然后将表达BmNPV的多角体基因序列polh克隆入所述带有AP2基因的重组载体中AP2基因的上游，即形成带有polh‑AP融合基因片段的重组载体；接着polh‑AP融合基因片段克隆入表达载体，得到带有polh‑AP融合基因片段表达载体，将该带有polh‑AP融合基因片段表达载体转化表达宿主细胞，表达宿主细胞经培养，表达带有所述抗菌肽AP2的融合蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹翠平，李卫芬，相兴伟，陈琳，吴小锋，
申请(专利权)人：苏州品天下农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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