一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建制造技术

本发明专利技术涉及一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建。采用的技术方案是：(1)PCR扩增GST标签蛋白序列、SacR调控序列以及目的蛋白序列；(2)PCR产物与载体pHY300-PLK连接，构建重组质粒；(3)重组质粒转化枯草芽孢杆菌WB600，蔗糖诱导蛋白表达，得到融合蛋白。本发明专利技术通过PCR扩增、酶切、连接、转化和筛选，证实未加蔗糖诱导之前，仅有极低的痕量融合蛋白表达，诱导后32小时得到高效表达的融合蛋白，该融合蛋白通过对目的蛋白的抑菌效果检测以及针对GST标签蛋白的Western-Blot检测实验确定两种蛋白正确融合与表达。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建
本专利技术涉及大肠-枯草穿梭诱导载体的构建和转化及表达。
技术介绍
近些年来，枯草芽孢杆菌基因组的成功测序催化了枯草芽孢杆菌作为外源蛋白分泌载体的研究，成绩斐然。基于全基因组的测定，使得通过信号肽预测软件经生物信息学分析识别信号肽并确认分泌蛋白成为可能。结合信号肽预测结果以及已知的分泌蛋白基因结构，将有可能构建一个新的分泌蛋白组(Secretome),其中包含各种已知的及未知的分泌蛋白信息。通过此种方法，预测得到的枯草芽孢杆菌蛋白质组中已含有4107种蛋白，即占总蛋白25%的蛋白序列含有膜定位信号。枯草芽孢杆菌表达系统的优点是:(1)能将蛋白表达产物高效分泌培养基中，在多数情况下，经芽孢杆菌分泌后真核生物的异源重组蛋白就是经过简单折叠的天然构并且具备原有的生物活性；(2)许多芽孢杆菌在传统发酵工业中已经有几十年的历史，它们无致病性而且不产生内毒素；(3)芽孢杆菌的分子遗传背景清楚，生长迅速，培养条件简单。但是由于膜定位能力的缺乏、转移前折叠、转移折叠缓慢、低效转移以及错误折叠和蛋白酶水解等因素，外源蛋白的表`达进展受限。外源蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠杆菌?枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建，其特征在于方法如下：1）SacR调控序列的制备：提取枯草芽孢杆菌基因组；根据NCBI公布的SacB序列，以提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计上下游引物pS1及pS2，在两端分别添加Xba?I和Nde?I酶切位点，PCR扩增获得SacR调控序列；所述的上游引物pS1的序列为GCGTGCTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATC；所述的下游引物pS2的序列为GAATTCCATATGCGCAAACGCTTGAGTTG；2）制备GST标签蛋白序列；3）获得目的蛋白序列；4）各元件的连接以及与载体的连接：连接经Quick?Cut?Nde?I内切酶...

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建，其特征在于方法如下: 1)SacR调控序列的制备:提取枯草芽孢杆菌基因组；根据NCBI公布的SacB序列，以提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计上下游引物PSl及pS2，在两端分别添加Xba I和Nde I酶切位点，PCR扩增获得SacR调控序列； 所述的上游引物 PSl 的序列为 GCGTGCTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATC ； 所述的下游引物PS2的序列为GAATTCCATATGCGCAAACGCTTGAGTTG ； 2)制备GST标签蛋白序列； 3)获得目的蛋白序列； 4)各元件的连接以及与载体的连接:连接经QuickCut Nde I内切酶处理的SacR片段与GST片段，得到SG序列，经Quick Cut Vsp I酶切后与同样经Quick Cut Vsp I酶酶切的目的蛋白序列片段进行连接，得到重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秋雨，金莉莉，王宇，王铮，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：