一种敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT及其构建方法技术

一种敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT及其构建方法，它涉及一种自杀质粒及其构建方法。敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT由prcK基因左侧片段prcKL、prcK基因右侧片段prcKR、四环素抗性基因和质粒pUC18构成。构建方法：一、扩增片段prcKL；二、得到质粒pUC18-KL；三、扩增片段prcKR；四、得到质粒pUC18-KLKR；五、扩增四环素抗性基因Tet；六、得到敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT。本发明专利技术用于生物工程研究领域。

【技术实现步骤摘要】
—种敲除PrcK基因的自杀质粒pYTKLKRT及其构建方法
本专利技术涉及一种自杀质粒及其构建方法。
技术介绍
近年来研究中研究人员发现在某些G+菌QS体系中的AIP不仅仅是信号分子，它还具有抗菌能力，如乳酸乳球菌的nisin，植物乳杆菌的植物乳杆菌素等等。这些抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)的基因簇中除了含有ABC转运体编码基因外,还有一个辅助蛋白(accessory protein, AP)编码基因，它们的产物组成了 AMP输出和处理体系。AMP的结构基因都位于其相应的免疫蛋白基因之前，产生的AMP大多数富含半胱氨酸，具有疏水性，而且，经研究发现，AMP的最大生产量与产生菌的非最佳生长条件有关。根据AMP的性质不同，可将AMP分为两大类:一类是I型AMPs或硫醚抗生素，它们是一些对热稳定的肽类，在被分泌之前会被进行高度的翻译后修饰，如nisin、枯草菌素；另一类是II型AMPs或热稳定的AMPs，它们具有特征性的双甘氨酸基序，分泌之前不存在修饰过程，但在分泌后，前体肽的N端会有一个片段被移去，如植物乳杆菌素、乳酸杆菌素P坐寸O副干酿乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HDL 7,革兰氏阳性菌,2003年从齐齐哈尔丰源食品有限公司乳酸酸菜发酵液中分离获得。它最大的特点是在其发酵液中可产生抑制多种G+、G-和酿酒酵母生长的肽类物质，分子量在IOkD左右，热稳定，酸性条件下(PH2~6)活性高，其性能比目前市面上常用的nisin更为优越，因为nisin能有效的抑制革兰氏阳性菌如一些腐败菌、致病菌和芽孢菌，而对革兰氏阴性菌起的作用并不大，甚至不起作用。同时经过研究还发现，当将高密度菌体发酵液OlO11个/mL)添加到低密度菌体发酵液(<105个/mL)中时，可促进低密度菌体中这种AMP的生成；发酵24h和48h的菌体发酵液，其抑菌能力相差较大。以上种种现象说明，该菌产生的这种AMP的产量可能受到菌群密度影响和控制。国外Nakayama等通过PCR方法克隆到了副干酪乳杆菌拟群体效应相关基因(prcA.prcK和prcR)，但对于这些基因在群体感应中的具体功能，以及AMP产量是否与群体感应有关尚不明确。目前，基因功能的研究方法主要有两种:一种是增强基因表达，然后对获得的表达产物进行研究；另一种是减弱或者终止基因表达，通过观察生物整体功能的变化，进而推测相应的基因功能。由于第一种方法往往不能反映基因产物的真实表达情况，而逐渐被抛弃。第二种方法中RNA干扰技术(RNAi)实际上只是在转录后水平上降低基因的表达，并不象基因敲除技术可以完全把基因从基因组中剔除掉，有时也会因背景的不干净导致产生的表型难以分析。因此，采用基因敲除技术成为了目前最为理想和合适的方法。基因敲除技术根据基因打靶的目的不同，载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体。由于参照Genbank提供的prcK基因序列信息所设计的引物对，反复试验都无法得到副干酪乳杆菌HDl.7的prcK基因特异性条带，因此“副干酪乳杆菌HDl.7prcK基因敲除载体构建及其电转化条件初步确立”中不得不采用拼接的方式构建插入型基因敲除载体，不但同源臂的长度短，仅有550bp，而且构建步骤繁琐、成功率低。又因为无法找到满足四环素抗性基因(tet基因)插入prcK-550片段要求的酶，该方法还不得已在tet基因扩增上游引物中设计了一个突变的碱基，导致突变位点的引入。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有副干酪乳杆菌HDl.7的prcK基因敲除载体构建过程中自杀载体内同源片段长度短，构建步骤繁琐、成功率低，引入突变位点的缺陷，而提供的。本专利技术敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT由prcK基因左侧片段prcKL、prcK基因右侧片段prcKR、四环素抗性基因和质粒pUC18构成；片段prcKL的核酸序列如SEQ IDNO:1所示；片段prcKR的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。上述敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT按以下步骤进行构建:一、以L.paracasei HDl.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因左侧片段prcKL,扩增片段prcKL的上游引物为prcKL-up，prcKL-up的核苷酸序列为5?-CCGGAGCTCTACCTTAATGATTTAGATGCGAGCG-3’，扩增片段 prcKL 的下游引物为 prcKL-down，prcKL-down 的核苷酸序列为 5’ -GTCGGTACCGATTGTTCCTTCGGTGTGGATGTGT-3’，PCR 扩增片段 prcKL 的反应体系为50μ L 由 10 μ L含Mg2+的 5 XPrimeSTAR Buffer、4 μ L浓度各为 2.5mmol/L 的 dNTP Mixture、10 μ L 浓度为 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因组 DNA、10 μ L 浓度为 lpmol/ μ L 的prcKL-up> 10 μ L 浓度为 lpmol/ μ L 的 prcKL-down>0.5 μ L 浓度为 2.5U/ μ L 的 PrimeSTARHS DNA聚合酶和5.5 μ L灭菌ddH20组成；PCR扩增片段prcKL的反应条件为98°C预变性3min，98°C变性 10s、62°C退火 15s、72°C延伸 1.5min，共 30 个循环，再 72°C延伸 IOmin ；二、用限制性内切酶Sac I及Kpn I对质粒pUC18和步骤一获得的片段prcKL分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μ I由16.5μ I prcKL双酶切片段、5 4 1质粒？阢18双酶切片段、2.5“110父了40嫩Ligase Buffer和I μ I浓度为3U/ μ L的T4DNA连接酶组成，16 °C过夜连接，得到质粒pUC18_KL ；三、以L.paracasei HDl.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因右侧片段prcKR，扩增片段prcKR的上游引物为prcKR-up，prcKR-up的核苷酸序列为5?-GTCGGTACCGGTTTTGCCGTCATCAGCGCACTTG-3’，扩增片段 prcKR 的下游引物为 prcKR-down，prcKR-down 的核苷酸序列为 5’ -CCGCTGCAGACTAATCAGCTGGACTAAGGTGTAT-3’, PCR 扩增片段 prcKR 的反应体系为50μ L由 10μ L 含 Mg2+的 5 XPrimeSTAR Buffer、4 μ L浓度各为 2.5mmol/L 的 dNTP Mixture、10 μ L 浓度为 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因组 DNA、10 μ L 浓度为 lpmol/ μ L 的prcKR-up> 10 μ L 浓度为 lpmol/ μ L 的 prcKR-down>0.5 μ L 浓度为 2.5U/ μ L 的 PrimeSTARHS DNA聚合酶和5.5 μ L灭菌ddH20组成；PCR扩增片段prcKR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT，其特征在于敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT由prcK基因左侧片段prcKL、prcK基因右侧片段prcKR、四环素抗性基因和质粒pUC18构成；片段prcKL的核酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；片段prcKR的核酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种敲除PrcK基因的自杀质粒pYTKLKRT，其特征在于敲除prcK基因的自杀质粒PYTKLKRT由prcK基因左侧片段prcKL、prcK基因右侧片段prcKR、四环素抗性基因和质粒PUC18构成；片段prcKL的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；片段prcKR的核酸序列如SEQ IDNO:2所示。2.上述敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT的构建方法，其特征在于敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT按以下步骤进行构建: 一、以L.paracasei HDl.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因左侧片段prcKL，扩增片段prcKL的上游引物为prcKL-up，prcKL-up的核苷酸序列为5’-CCGGAGCTCTACCTTAATGATTTAGATGCGAGCG-3’，扩增片段prcKL的下游引物为prcKL-down，prcKL-down的核苷酸序列为 5’-GTCGGTACCGATTGTTCCTTCGGTGTGGATGTGT-3’，PCR扩增片段prcKL 的反应体系为 50 μ L由 10 μ L含Mg2+的 5XPrimeSTAR Buffer、4 μ L浓度各为 2.5mmol/L 的 dNTP MixtureUOy L浓度为 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因组 DNA、10 μ L 浓度为 lpmol/μ L 的 prcKL-up、10 μ L 浓度为 lpmol/ μ L 的 prcKL_down、0.5 μ L 浓度为 2.5U/ μ L 的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶和5.5 μ L灭菌ddH20组成；PCR扩增片段prcKL的反应条件为98°C预变性3min，98°C变性10s、62°C退火15s、72°C延伸1.5min，共30个循环，再72°C延伸IOmin ； 二、用限制性内切酶SacI及Kpn I对质粒pUC18和步骤一获得的片段prcKL分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μ I由16.5μ I prcKL双酶切片段、5 4 1质粒？阢18双酶切片段、2.5“110父了40嫩Ligase Buffer和I μ I浓度为3U/μ L的T4DNA连接酶组成，16°C过夜连接，得到质粒pUC18_KL ； 三、以L.paracasei HDl.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因右侧片段prcKR，扩增片段prcKR的上游引物为prcKR-up，prcKR-up的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCGGTTTTGCCGTCATCAGCGCACTTG-3’，扩增片段prcKR的下游引物为prcKR-down，prcKR-down的核苷酸序列为 5’-CCGCTGCAGACTAATCAGCTGGACTAAGGTGTAT-3’，PCR扩增片段prcKR 的反应体系为 50 μ L由 10 μ L含Mg2+的 5XPrimeSTAR Buffer、4 μ L浓度各为 2.5mmol/L 的 dNTP MixtureUOy L浓度为 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因组 DNA、10 μ L 浓度为 lpmol/μ L 的 prcKR-up、10 μ L 浓度为 lpmol/ μ L 的 prcKR-down、0.5 μ L 浓度为 2.5U/ μ L 的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶和5.5 μ L灭菌ddH20组成；PCR扩增片段prcKR的反应条件为98°C预变性3min，98°C变性10s、55°C退火15s、72°C延伸1.5min，共30个循环，再72°C延伸IOmin ； 四、用限制性内切酶PstI及Kpn I对质粒pUC18-KL和步骤三获得的片段prcKR分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μ I由16.5μ I prcKR双酶切片段、5 4 1质粒口此18-此双酶切片段、2.5 4 110父了40嫩Ligase Buffer和I μ I浓度为3U/ μ L的T4DNA连接酶组成，16 °C过夜连接，得到质粒pUC18_KLKR ； 五、以pBR322质粒为模板PCR扩增四环素抗性基因Tet，扩增Tet的上游引物为Tet-up, Tet-up 的核苷酸序列为 5’-CCGGGTACCTCTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛菁萍，王洋，由田，平文祥，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：